酰胺酶催化合成手性氨基酸的研究进展

顾诚伟，曹成浩，金利群，薛亚平

(浙江工业大学 生物工程学院，浙江 杭州 310014)

酰胺酶催化合成手性氨基酸的研究进展

顾诚伟，曹成浩，金利群，薛亚平

(浙江工业大学 生物工程学院，浙江 杭州 310014)

手性氨基酸广泛应用于医药、农药、食品、化妆品等行业，开发高效、原子经济性高、环境友好的手性氨基酸合成方法具有重要的意义.酰胺酶由于其底物范围广、立体选择性专一、反应条件温和，在制备光学纯氨基酸方面具有巨大潜力.对酰胺酶的来源、分类、作用机理及在制备手性氨基酸中的应用等方面进行了综述，重点介绍了酰胺酶在制备D-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-苯甘氨酸、O-甲基-D-丝氨酸和L-2-羧酸-哌嗪中的应用.探讨了酰胺酶存在的问题与未来的发展趋势，随着基因工程技术研究的不断深入，将会有更多的酰胺酶被开发出来并用于手性氨基酸的生产.

酰胺酶；手性氨基酸；酶法拆分；生物催化

手性氨基酸由于存在不同的生理作用而被广泛应用于医药、农药、食品和化妆品中.在医药行业中，L-高苯丙氨酸是制备依那普利、赖诺普利、喹那普利、雷米普利、苯那普利和群多普利等药物的关键中间体[1]；L-高丙氨酸是制备左乙拉西坦或布瓦西坦(抗癫痫药)和乙胺丁醇(抗结核药)等药物的关键中间体[2]；D-氨基酸常用于半合成抗生素的合成，包括青霉素头孢类抗生素的母核，例如使用D-天冬氨酸和阿莫西林为原料化学合成阿扑西林[3]；含有D-氨基酸的整合蛋白可以抑制一些疾病的侵袭，如包含D-氨基酸的整合蛋白可以抑制前列腺癌和肺部定植[4]；含D-氨基酸的多肽抑制剂可以预防或早期治疗阿尔茨海默病[5].在农药行业中，L-草铵膦是一种广谱、触杀型、灭生型、非残留除草剂，前景非常广阔.在食品行业中，L-谷氨酸钠为调味剂，L-赖氨酸、L-半胱氨酸为食品添加剂，D构型的丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸，亮氨酸和缬氨酸，味道比L-异构体更甜美[6].含有D-氨基酸的甜味剂甜度比只含有L-氨基酸的甜味剂甜度高很多[7].D-苯甘氨酸是人造甜味剂阿巴斯甜的重要原料[8]，不但高效而且热量低，减肥人士或糖尿病患者以此作为糖的替代品.在化妆品行业中，D-天冬氨酸具有抗氧化和促进胶原蛋白合成的作用，D-谷氨酸可以促进皮肤恢复并减少皱纹的形成，D-色氨酸具有减少紫外线损伤的能力，以上氨基酸均可用于水油型乳液护肤化妆品中[9].

手性氨基酸的合成方法包括化学法、发酵法和生物酶法.传统化学法制备手性氨基酸需要开发手性催化剂，存在催化剂价格较贵等缺点，不利于手性氨基酸的大规模生产；发酵法是生产手性氨基酸最主要的方法，但是能够生产的手性氨基酸种类有限，特别是很难生产D-氨基酸；相比之下，利用外消旋混合物酶法生产光学纯异构型氨基酸，产生副产物少、反应条件温和，具有潜在的优势.可以用来制备氨基酸的生物酶包括水解酶、氧化还原酶和转氨酶等.水解酶又包括海因酶偶联N-氨甲酰水解酶、N-酰基水解酶、氨基酸酰胺酶和氨肽酶等；氧化还原酶最常见的为氨基酸氧化酶和氨基酸脱氢酶.酰胺酶(EC 3.5.1.4)能够水解氨基酸酰胺的酰胺键生成手性氨基酸和氨气，可将外消旋氨基酸酰胺拆分成纯对映异构体的氨基酸，若和氨基酸酰胺消旋酶协同催化，外消旋氨基酸可完全转化为手性氨基酸.来自各种不同微生物的立体选择性酰胺酶在工业生产纯光学活性化合物中具有潜在用途，引起人们广泛的关注，笔者综述了利用酰胺酶生产手性氨基酸的方法.

1 酰胺酶的来源及分类

酰胺酶来源十分广泛，存在于动物的肾脏和胰腺、植物和微生物中，如老鼠的肝脏提取物[10]、猪的大脑[11]、橙皮[12]等.目前所报道的用来制备手性氨基酸的酰胺酶主要来源于微生物，如可用于制备L-构型氨基酸的产L-酰胺酶菌株主要有假单孢菌属PseudomonasazotoformansIAM 1603[13-14]、苍白杆菌属OchrobactrumanthropiNCIMB 40321[15]、红球菌属Rhodococcussp.[16]和RhodococcusrhodochrousPA-34[17]、假诺卡氏菌属Pseudonocardiathermophile[18]、黄杆菌属FlavobacteriumaquatileZJB-09211[19-20]、短杆菌属BrevibacteriumR312[21]、曲霉属Aspergillusfurmigatus[22]、单胞菌属BrevundimonasdiminutaTPU 5720[23]、黄色杆菌属XanthobacterflavusNR303[24]、代尔夫特菌属DelftiatsuruhatensisZJB-05174[25]和食清洁剂细小棒菌ParvibaculumlavamentivoransZJB14001[26]等.可用于制备D-构型氨基酸的产D-型酰胺酶菌株主要有短杆菌属BrevibacteriumiodinumTPU 5850[27]、苍白杆菌属OchrobactrumanthropiC1-38[28-29]和OchrobactrumanthropiSV3[30-34]、短芽孢杆菌属BrevibacillusborstelensisBCS-1[35]、β-变形杆菌Variovoraxparadoxus19-3[36]、代尔夫特菌属Delftiaacidovorans[37]和短杆菌属BrevibacteriumepidermidisZJB-07021[38]等.

许多学者尝试对酰胺酶进行分类，但这些酶的分类并没有被广泛认同.根据立体选择可将酰胺酶分为L-构型酰胺酶(LaaA)和D-构型酰胺酶(DaaA)，但酰胺酶的立体选择性受底物、温度和pH等因素的影响[39]，根据酰胺酶对不同底物的催化活性可将酰胺酶分为对映选择性酰胺酶、脂肪酸酰胺酶、芳香族酰胺酶、D-氨肽酶、芳基酰基酰胺酶、α-氨基酰胺酶及广谱氨基酸酰胺酶[40].Chebrou等[41]对酰胺酶进行了分子生物学研究，通过酰胺酶氨基酸序列在数据库的多重比对将酰胺酶分为腈水解酶家族和AS(Amidase signature)家族两大类.腈水解酶家族酰胺酶以同源四聚体或六聚体的形式存在，催化中心为Glu，Cys和Lys组成的三联体[42]，该类酶只对脂肪族酰胺具有较高的活性.AS家族酰胺酶则以同源二聚体或八聚体形式存在，显示出一个高度保守的GGSS区域，催化中心为Ser，Ser和Lys组成的三联体[43]，该类酰胺酶对芳香族、脂肪族和杂环酰胺具有较高的活性.

2 酰胺酶的催化机理

尽管人们研究酰胺酶已经很多年，但是关于酰胺酶的催化机理并不完全确定，Mileni等[44]阐述了脂肪酸酰胺酶FAAH的反应机理，FAAH属于AS酰胺酶家族的一员，来源于细菌、古细菌和真核生物.FAAH的催化机理可概括为以下4个步骤：1) 通过激活的丝氨酸亲核进攻底物的酰胺羰基，生成一个酶联四面体结构的中间体；2) 随后一部分底物离去(氨基)形成酰基-酶中间体；3) 被一个活化水分子攻击，生成第二个酶联四面体结构的中间体；4) 分解成羧酸化合物，酶得到再生.FAAH酰胺酶的催化机理为

3 酰胺酶在制备手性氨基酸中的应用

酰胺酶在工业制备光学纯氨基酸方面具有巨大的潜力，随着对氨基酸酰胺酶研究的深入，越来越多的氨基酸酰胺可以被酰胺酶特异性水解(表1).其中PseudomonasazotoformansIAM 1603[14]和BrevundimonasdiminutaTPU 5720[23]产L-特异性酰胺酶，分别以对脯氨酸酰胺(192.0 U/mg)和苯丙氨酸酰胺(29.6 U/mg)的酶活为相对酶活100%，其余菌产D-特异性酰胺酶，分别以对苯丙氨酸酰胺(7.9 U/mg)、蛋氨酸酰胺(131.4 U/mg)、丙氨酸酰胺(596.0 U/mg)和苯丙氨酸酰胺(367.0 U/mg)为相对酶活100%.这些酰胺酶均具有广泛的底物特异性，为了进一步提高氨基酸酰胺酶催化制备手性氨基酸的效率，研究者尝试从嗜热微生物中筛选耐热氨基酸酰胺酶[18,35]，提高酰胺酶的稳定性；利用定向进化技术提高酶的稳定性和活性[32]；使用添加剂提升酶的反应速率[19,35]；开发氨基酸酰胺消旋酶，实现酰胺酶的动态动力学拆分，使手性氨基酸理论收率达100%[45].这些研究为酰胺酶制备手性氨基酸的工业化提供了重要的理论依据.

表1 来源于不同微生物的酰胺酶对氨基酸酰胺的底物特异性1)

注：1) 酶活定义均为每分钟转化1 μmol底物生成产物所需要的酶量，所有数值均为相对酶活.

3.1 酰胺酶制备D-苯丙氨酸

D-苯丙氨酸在医药、农药和食品领域有着重要的应用，是用于治疗糖尿病、高血压和抑郁症等疾病的原料药，属于非天然氨基酸，无法用发酵法生产.Komeda等[31]利用来自OchrobactrumanthropiSV3的D-特异性氨基酰胺酶催化D-苯丙氨酸酰胺制备D-苯丙氨酸，温度为45 ℃时达到最高酶活，对L-苯丙氨酸酰胺或其他L构型氨基酸酰胺无活性.随后，作者为了提高该酶的热稳定性，通过定向进化理论筛选得到热突变酶，与野生型相比，热突变酶最适温度提高5 ℃，表观Km值相同，Vmax提升约3倍，2 h可将1 mol/L的外消旋苯丙氨酸酰胺完全拆分，相同时间转化率是原野生型酶的1.7倍[32].生物催化剂的稳定性是酶法生产最重要的因素之一.一般来说，嗜热菌产生的耐热酶具有高的热稳定性、pH稳定性和有机溶剂稳定性.Baek等[35]首次报道从嗜热菌中获得D-氨基酸酰胺酶，将从嗜热菌BrevibacillusborstelensisBCS-1中获得的D-蛋氨酸酰胺酶用于制备D-苯丙氨酸，酶的最适pH和温度分别为9.5和70 ℃，产物D-苯丙氨酸的e.e.和E值分别为97.1和196%.

通过外消旋氨基酸酰胺制备手性氨基酸，氨基酸最高收率只有50%，因为特异性氨基酸酰胺酶只催化单一构型底物，如果氨基酸酰胺消旋酶可以与特异性酰胺酶协同催化，可将其余氨基酸酰胺拆分为手性氨基酸，使得光学纯氨基酸的收率达到100%，因此，实现氨基酸酰胺动态动力学拆分的关键是氨基酸酰胺消旋酶.Asano等[45]首次发现来自菌株Achromobacterobae的α-氨基-ε-己内酰胺消旋酶(ACL消旋酶)可以将氨基酸酰胺作为底物，并且对大多数氨基酸酰胺均有活性，如L-2-氨基丁酸酰胺、L-丙氨酸酰胺、L-苏氨酸酰胺、L-蛋氨酸酰胺和L-苯丙氨酸酰胺等.随后利用ACL消旋酶和D-特异性酰胺酶(来自OchrobactrumanthropiC1-38)协同催化L-丙氨酸酰胺(45 mmol/L)，7 h后D-丙氨酸收率达到99.7%.该系统可广泛应用于各种氨基酸酰胺类化合物，但ACL消旋酶对苯丙氨酸酰胺活性不高[28].Yasukawa等[34]又通过定向进化突变ACL消旋酶，得到突变ACL消旋酶(L19V/L78T)，该突变酶提高了对苯丙氨酸和苯丙氨酸衍生物(4-OH, 4-F, 3-F和2-F-Phe)的底物特异性，并且与耐热突变D-特异性氨基酸酰胺酶(OchrobactrumanthropiSV3)[32]共同表达，动态动力学拆分外消旋苯丙氨酸酰胺，D-苯丙氨酸酰胺首先被D-酰胺酶催化生成D-苯丙氨酸，L-苯丙氨酸酰胺在消旋酶的作用生成外消旋苯丙氨酸酰胺，22 h催化400 mmol/L的底物，收率和e.e.值分别为84%和99%.动态动力学拆分外消旋苯丙氨酸酰胺制备D-苯丙氨酸[25]的过程为

3.2 酰胺酶制备L-色氨酸

L-色氨酸广泛应用于医药和食品行业，可作为制备其他手性化合物的前体物质.发酵法和化学法均有很多生产L-色氨酸的方法，但是发酵法产量偏低，而化学法通常会产生D-构型的色氨酸.很多L-酰胺酶对色氨酸酰胺有活性，如表1中的两个产L-酰胺酶菌株，其酶活分别为0.38 U/mg[14]和12.14 U/mg[23]，但都没有得到规模化的应用.本实验室Xu等[20]利用产L-特异性酰胺酶的静息细胞FlavobacteriumaquatileZJB-09211从色氨酸酰胺催化制备L-色氨酸，L-色氨酸的e.e.和E值分别达到99.9%和200.但是由于色氨酸酰胺在水中的溶解度较差(20 mmol/L)，限制了催化反应进程.随后，Xu等[19]首次报道了添加水不溶性有机溶剂乙酸乙酯来提高酰胺酶的生产能力，结果显示当添加30%(体积分数)乙酸乙酯时，静息细胞的酶活达到最高5 118.62 U/g.成功将色氨酸酰胺的溶解度提高到200 mmol/L，转化率达到49.85%，产物L-色氨酸e.e.>99.95%.这种添加有机溶剂提高酰胺酶催化活性的方法，为某些氨基酸酰胺因为其本身在水中的溶解度低而导致催化效率低的情况提供了思路，也有利于将不溶性有机溶剂从酶反应体系中分离并且回收利用.

3.3 酰胺酶制备L-苯甘氨酸

L-苯甘氨酸是非天然的芳香族α-氨基酸，L-苯甘氨酸及其衍生物是一类重要的药物中间体，如L-邻氯苯甘氨酸是合成血小板抑制剂氯吡格雷的重要中间体.源自OchrobactrumanthropiNCIMB 40321[15]的L-特异性酰胺酶有广泛的底物特异性，对L-苯甘氨酸酰胺具有最高的活性，酶活达到2 000 nmol/(min·mg)，e.e.>99%.腈类化合物在微生物中可经两种方法转化为游离酸：第一种为腈水解酶直接将腈水解为相应的游离酸；第二种为腈在腈水合酶的作用下，先生成相应的酰胺，再由酰胺酶催化为游离羧酸.故酰胺酶可以和腈水合酶协同催化腈类化合物生成手性氨基酸，如Hensel等[46]直接利用全细胞Pantoeaendophytica26.2.2产生L选择性腈酰胺酶和腈水合酶催化苯甘氨酸腈，可获得e.e.值99%的L-苯甘氨酸.Wegman等[16]利用非选择性的腈水合酶和L选择性的氨基酸酰胺酶催化苯乙腈得到L-苯甘氨酸，产物L-苯甘氨酸和D-苯甘酰胺的相对收率分别达到48%和52%，e.e.值分别达到97%和99%以上.腈水合酶-酰胺酶催化苯甘氨腈制备L-苯甘氨酸的过程为

3.4 酰胺酶制备O-甲基-D-丝氨酸

拉科酰胺是重要的第二代药物之一，是一种辅助性治疗糖尿病和神经性疼痛的活性物质，O-甲基-D-丝氨酸是合成该药物的中间体，拉科酰胺中唯一的手性碳原子就来自O-甲基-D-丝氨酸.合成O-甲基-D-丝氨酸的方法不多，主要有两种：方法一以D-丝氨酸作为初始反应物；方法二以O-甲基-D,L-丝氨酸作为初始反应物.但两种方法均存在缺陷，D-丝氨酸是一种昂贵的手性试剂，若以它为初始反应物会造成成本的增加，而O-甲基-D,L-丝氨酸作为起始反应物，导致O-甲基-L-丝氨酸原料的浪费，降低了原子利用率.Wang等[30]报道了化学酶法动态动力学拆分O-甲基-D,L-丝氨酸酰胺制备光学活性O-甲基-D-丝氨酸的方法.以廉价的化合物丙烯酰胺作为起始物质，包括四步反应：溴化丙烯酰胺，醚化二溴丙酰胺，氨取代溴，酶动态动力学拆分.双酶系统包括ACL消旋酶(Locus, E01594)和D-特异性氨基酸酰胺酶(Locus, AB026907).10 h可完全催化300 mmol/L的D,L-O-甲基-D,L-丝氨酸酰胺，产物e.e.>99.8%，酶动态动力学拆分收率达到98.5%，总收率达到81.3 %.化学酶法合成O-甲基-D-丝氨酸的过称为

3.5 酰胺酶制备L-2-羧酸-哌嗪

L-2-羧酸-哌嗪属于非蛋白质氨基酸，是一种HIV蛋白酶抑制剂等药物的中间体，Eichhorn等[47]利用KlebsiellaDSM 9174产L-特异性酰胺酶制备L-2-羧酸-哌嗪，并且已经能达到规模化的转化，首先在1.5 L含外消旋2-甲酰胺-哌嗪的发酵罐中(1 L工作体积)培养KlebsiellaDSM 9174，16 h后，直接调节pH和温度等参数提高酶水解速率，36～72 h可完全水解22 g/L(173 mmol/L)的外消旋底物，反应结束后，离心去除细胞，通过浓缩酸化沉淀获得L-2-羧酸-哌嗪，收率达到41%，e.e.>99.4%.该工艺操作简便，产物容易分离，并且已被龙沙公司(Lonza AG)应用于商业化.Komeda等[14]利用来自PseudomonasazotoformansIAM1603的酰胺酶制备L-2-羧酸-哌嗪，并首次报道了酰胺酶可水解N端的笨重侧链，如含叔丁基侧链的酰胺.该酰胺酶可催化200 mmol/L的2-叔丁基酰胺-哌嗪，酶活达到3.0 U/mg，4 h转化率可达到25%左右，产物e.e.>95%.Eichhorn和Komeda以酰胺酶制备L-2-羧酸-哌嗪的过程分别为

3.6 酰胺酶制备其他氨基酸

酰胺酶还可以用于合成其他的氨基酸，如D-苯丙氨酸和D-叔亮氨酸等.Ozaki[48]等利用来自Arthrobactersp. NJ-26的D-特异性酰胺酶催化丙氨酸酰胺制备D-丙氨酸.通过全细胞反应，210 g/L(2.4 mol/L)的底物可产生105 g/L的D-丙氨酸，转化率达到49.2%，e.e.>99%.Brandão等[36]从外消旋叔亮氨酸腈出发，利用腈水合酶和D-氨基酸酰胺酶一锅法制备D-叔亮氨酸，由于底物抑制的存在，采取流加方式，D-叔亮氨酸质量浓度最高达到5 mg/mL.Egorova等[18]首次从嗜热放线菌Pseudonocardiathermophila中筛选到L-特异性酰胺酶，其制备2-苯基-丙氨酸可达到50%的转化率，e.e.>95%.Yamaguchi等[13]利用ACL消旋酶和L-特异性消旋酶分别制备了D-丙氨酸、D-2-氨基丁酸、D-色氨酸、D-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-色氨酸和L-甲硫氨酸，除D-色氨酸收率为94%外，其余氨基酸的收率均达到100%，产物e.e.值均大于99%，显示出良好的工业化应用前景.

4 结 论

过去几十年，酰胺酶已成功应用于工业化生产丙烯酸和异羟肟酸等化合物.随着众多酰胺酶的发现和酶改造技术的发展，逐渐克服了酰胺酶的一些缺点，如较低的热稳定性和pH稳定性，对底物和产物的低耐受性等，酰胺酶显示出巨大的应用潜力.当然，酰胺酶目前存在一些问题，如酰胺酶拆分氨基酸最高只能达到50%的收率，若要应用于实际生产，需将另一半未水解的构型去消旋化.在没有氨基酸酰胺消旋酶的情况时，化学消旋是可行的方法，但是化学消旋法一般反应条件剧烈，在消旋过程中底物易分解[49].在发现氨基酸酰胺消旋酶后，成功实现了氨基酸酰胺的动态动力学拆分，但是由于氨基酸消旋酶和氨基酸酰胺酶有着不同的酶学性质，使得动态动力学拆分与动力学拆分相比，不得不降低反应体系的底物浓度.在今后的发展中，还需筛选高活性的野生型菌株并采用基因工程技术提升酰胺酶以及酰胺消旋酶的催化效率，本实验室Zheng[50]等建立了一种新的立体选择性酰胺的筛选模型，可快速鉴定酰胺酶的选择性和活力，提高筛选效率.由于某些化合物特别是手性化合物很难通过化学法进行大规模生产，而生物酶法又已经成功应用于这些手性化合物的生产，故酰胺酶法制备手性氨基酸有足够的发展空间.

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(责任编辑：朱小惠)

Research progress of enzymatic synthesis of chiral amino acids by amidase

GU Chengwei, CAO Chenghao, JIN Liqun, XUE Yaping

(College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Chiral amino acids have been widely used in pharmaceuticals, pesticides, food and cosmetics industry. It is necessary to develop new, efficient and environmental friendly methods for the synthesis of chiral amino acids. Amidase possesses a broad substrate spectrum and high enantioselectivity for the preparation of optically pure amino acids under mild conditions. Here, the origin, classification, mechanism and application of amidase in the preparation of chiral amino acids are reviewed. The synthesis of D-phenylalanine, L-tryptophan, L-phenylglycine,O-methyl-D-serine and L-piperazine-2-carboxylic acid was described. The existing problems and future development of amidase are also discussed. In the near future, an increasing number of novel amidases will be screened and their potential in the production of chiral amino acids will be further exploited.

amidase; chiral amino acids; enzymatic resolution; biocatalysis

2017-04-20

国家自然科学基金资助项目(21602199)

顾诚伟(1991—)，男，浙江嘉兴人，硕士研究生，研究方向为生物转化与生物催化，E-mail:gcw0502@qq.com.通信作者：薛亚平教授，E-mail:xyp@zjut.edu.cn.

Q556+.4

A

1674-2214(2017)03-0162-08