谷氨酸棒杆菌分支链氨基酸合成的转录调控

马 倩，张权威，隋进廷，谢希贤

(1.天津科技大学 生物工程学院，天津 300457；2.代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津 300457； 3.天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室，天津 300457)

谷氨酸棒杆菌分支链氨基酸合成的转录调控

马 倩1,2,3，张权威1，隋进廷1，谢希贤1,2,3

(1.天津科技大学 生物工程学院，天津 300457；2.代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津 300457； 3.天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室，天津 300457)

谷氨酸棒杆菌中存在复杂的转录调控系统，其调控机制不清晰的问题严重制约着代谢工程策略的选择与应用.目前，针对谷氨酸棒杆菌分支链氨基酸合成的转录调控网络展开了一系列研究，发现了诸多转录调控因子及其靶向调控基因，而其具体调控机制及不同调控模块间的相互作用仍有待进行深入研究.随着转录调控网络的深入研究，将为谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造提供更有方向性的指导.目前，对谷氨酸棒杆菌中心碳代谢、分支链氨基酸合成过程中重要转录调控因子进行了相应的介绍.

谷氨酸棒杆菌；组学；代谢工程

随着基因组测序和代谢途径分析技术的发展，人们获得了谷氨酸棒杆菌较为清晰的代谢途径信息，并以此为基础对代谢途径进行系统改造，以实现特定产品的高效合成.然而，谷氨酸棒杆菌中存在精细复杂的转录调控系统，通过影响相关基因的表达，对人为代谢干预或环境刺激产生内部调控[1-2]，进而影响局部代谢途径改造的效果与稳定性，导致很多基因工程菌难以成功应用于工业生产过程.因此，对谷氨酸棒杆菌进行深入的转录调控研究，阐释细胞的转录调控机制，是指导代谢工程改造，充分发挥谷氨酸棒杆菌的工业应用优势进行新产品开发的迫切需求.系统生物学研究手段包括基因组学、转录组学、代谢组学、蛋白组学和通量组学等，可以获得研究对象整体代谢途径和调控网络的信息[3].将组学应用于谷氨酸棒杆菌的转录调控研究，可以为进一步的代谢工程改造提供信息基础与理论指导[4].

在转录调控研究中，系统生物学发挥着重要的作用[5-6].转录调控因子的发现，通常基于基因组的生物信息学分析；其靶向调控基因的发现，可以通过对比该转录调控因子基因缺失株与对照组的转录组、蛋白组等组学变化[5]，并结合后续相关实验进行验证.而对转录调控机制的深入研究，更需要结合转录调控引发的蛋白质表达、代谢物积累等变化来探索上游转录调控与下游代谢的相互联系，剖析转录调控的引发、过程与结果[4]，因而需要结合蛋白组、代谢组等研究手段开展研究.

1 分支链氨基酸的微生物合成

分支链氨基酸包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，这些均为人体所需的必需氨基酸，只能通过外界摄取获得.它们不仅具有调节机体代谢和免疫力的功能，还能增加机体运动中蛋白质的合成，降低肌肉蛋白的分解和损伤.同时也是一类广泛应用于医药、食品及饲料行业中的营养补充剂[7].因而，分支链氨基酸(L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸)作为高附加值的氨基酸产品，被广泛应用于食品、医药和保健品等领域.

谷氨酸棒杆菌在分支链氨基酸的工业生产中发挥着重要作用.谷氨酸棒杆菌中分支链氨基酸的合成从丙酮酸出发[8]，经过一系列相同或相关酶的催化，最终形成具有高附加值的不同分支链氨基酸产品.分支链氨基酸在合成路径与转运过程中，存在诸多相同酶的催化，相互联系紧密.其中，L-缬氨酸与L-异亮氨酸合成的最后四步反应均分别由乙酰羟酸合酶(Acetohydroxy acid synthase，AHAS)、乙酰羟酸同分异构体还原酶(Acetohydroxy acid isomeroreductase，AHAIR)、二羟酸脱水酶(Dihydroxy acid dehydratase，DHAD)和转氨酶(Transaminase，TA)催化.L-缬氨酸与L-亮氨酸的合成路径中存在共同的中间产物α-酮异戊酸，最后一步转化均由转氨酶TA催化.三种分支链氨基酸均通过BrnEF蛋白的转运作用，运输至胞外.不同分支链氨基酸产品合成的调控中，存在着密切的相互影响与作用，如转录调控因子LtbR可以抑制leuCD和leuB基因的表达，影响L-亮氨酸的合成从而影响共同底物的积累(如丙酮酸)，进而对L-缬氨酸和L-异亮氨酸的合成产生影响.谷氨酸棒杆菌中分支链氨基酸的合成途径为[9]

2 分支链氨基酸合成的转录调控研究现状

转录调控主要通过转录调控因子与相应靶基因的结合，在转录水平上强化或抑制靶基因的表达，进而实现对细胞内代谢过程的调控.按照转录调控的范围大小，分为全局调控、主调控和局部调控三种类型，不同类型的转录调控之间存在着层级调控，形成复杂的转录调控网络[10-11].基于转录调控的代谢工程改造，在提高菌株性能、获得优良性状方面，已经表现出重要的作用[10,12-13].如来源于耐辐射异常球菌(Deinococcusradiodurans)中的全局转录调控因子IrrE已经被成功用于多种微生物抗逆模块的构建[14].目前，在谷氨酸棒杆菌中，逐渐开展了转录调控的相关研究[5,15]，已利用基因组生物信息学分析与实验验证相结合的方法，发现159 个编码转录调控因子的基因[11]，它们构成了谷氨酸棒杆菌中必需的最小转录调控网络，通过层级调控影响近3 000 个蛋白编码基因的表达[16].具体到分支链氨基酸的合成，已发现的与中心碳代谢、分支代谢和转运相关的转录调控因子主要有GlxR，SugR，RamA，RamB，GntR1/2，LtbR和Lrp等.这些转录调控因子的特性以及它们调控的与分支链氨基酸合成相关的基因如表1所示.其中，GlxR是一个全局调控转录因子，其调控的过程包括糖吸收、糖酵解与糖异生，乙酸、乳酸和葡萄糖酸代谢，芳香化合物降解，有氧与无氧呼吸，谷氨酸吸收与氮素同化，脂肪酸合成，脱氧核苷酸合成，细胞应激反应等[11].SugR，RamA和RamB主要调控碳代谢，GntR1/2与细胞内葡萄糖酸代谢的转录调控过程有关[5].从表1中可以看出：涉及中心碳代谢的转录调控较为复杂，GlxR，SugR，RamA，RamB和GntR1/2协同调控中心碳代谢过程，这些转录调控因子之间存在着层级调控[16].Lrp主要调控分支链氨基酸转运，表现为促进brnEF基因的表达，Yin等[14]发现Lrp与BrnEF的共同过量表达，可以同时促进lysC，hom，thrB，ilvA和ilvBN等基因的表达，从而提高了L-异亮氨酸的合成效率.LtbR可以抑制leuB，leuCD和trpE基因的表达，从而影响L-亮氨酸和L-色氨酸的合成[17].从较简单的局部转录调控研究出发，探究其调控机制，并进一步探究局部调控与其他转录调控模块的相互影响与作用关系，是逐渐获得清晰的转录调控网络信息的有效手段.

表1 谷氨酸棒杆菌中与分支链氨基酸合成、转运相关的转录调控因子信息1)

注：1) “+”表示增强作用；“-”表示抑制作用.

3 基于转录调控的分支链氨基酸代谢工程改造

目前，基于一些简单转录调控过程开展的代谢工程改造已经取得了一些成果，如Yin等[14]通过将L-异亮氨酸生产菌中转运L-异亮氨酸双组分转运蛋白BrnEF的操纵子及其转录调控因子Lrp单独或组合克隆到穿梭载体pDXW-8中，使L-异亮氨酸的产量提高了63%.Brune等[17]发现谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的转录调节子Cg1486(目前称为LtbR)缺失突变株中编码亮氨酸生物合成途径酶的leuB和leuCD基因的转录增强，通过RT-PCR检测显示leuC和leuD基因表达量增强约100 倍，leuB基因表达量增强11.8 倍.Vogt等[18]通过敲除leuBCD基因的转录调节子LtbR增强leuBCD的表达量，进一步敲除编码转录调节基因IolR使葡萄糖的摄取量增加，最终在补料分批条件下，L-亮氨酸积累量超过24 g/L，接近L-亮氨酸在水中的最大溶解度.Chen等[19]则将Lrp调控与L-缬氨酸合成途径中的关键酶改造相结合，通过切断平行的相关支路及过表达ilvB，ilvN和ilvC等关键酶基因，大大提高了谷氨酸棒杆菌产L-缬氨酸的量.然而，谷氨酸棒杆菌中大部分转录调控的机制以及不同转录调控模块之间的相互作用关系仍然不清晰，影响了人们对谷氨酸棒杆菌转录调控网络的整体认识，并且制约着谷氨酸棒杆菌中代谢工程策略的运用以及工业应用的效果.

4 结 论

谷氨酸棒杆菌中存在复杂的转录调控系统，其调控机制不清晰的问题严重制约着代谢工程策略的选择与应用.分支链氨基酸(L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸)的合成过程将中心碳代谢与分支合成、物质转运等过程紧密联系起来，因而是研究谷氨酸棒杆菌转录调控网络的良好素材.多种组学研究手段的综合运用，将使谷氨酸棒杆菌基因组的结构和功能更加清晰，进而发展出全面且易于理解的基因组编码目录，最终明确转录调控基因编码的产物是如何共同作用使细胞的代谢有序进行的，并且对于解析谷氨酸棒杆菌整体转录调控网络构成与相互影响关系具有重要的作用.利用获得的生物信息，可以更好地绘制代谢工程改造的蓝图，为未来代谢改造并使基因产物承担新功能提供研究方向，对新产品的开发、菌株生产能力的提高有望做出巨大贡献.

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(责任编辑：朱小惠)

The investigation and trend of the transcriptional regulation for the synthesis of branched chain amino acids inCorynebacteriumglutamicum

MA Qian1,2,3, ZHANG Quanwei1, SUI Jinting1, XIE Xixian1,2,3

(1.College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 2.National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology, Tianjin 300457, China; 3.Tianjin Engineering Lab of Efficient and Green Amino Acid Manufacture, Tianjin 300457, China)

The complicated transcriptional regulation system inCorynebacteriumglutamicum, as well as its unclear regulation mechanism greatly restricted the metabolic engineering strategies applied to engineerC.glutamicum. Nowadays, a series of investigations have been conducted to explore the transcriptional regulation network for the synthesis of branched chain amino acids inC.glutamicum. A number of transcriptional regulators and their targeted regulatory genes have been identified, while the specific regulatory mechanisms and the interaction between different regulatory modules remain to be studied in depth. In this paper, the important transcriptional regulators in the process of carbon metabolism and branched chain amino acid synthesis inCorynebacteriumglutamicumwere introduced.

Corynebacteriumglutamicum; omics; metabolic engineering

2017-04-24

工业发酵微生物教育部重点实验室暨天津市工业微生物重点实验室(天津科技大学)主任基金项目(2016IM104)；天津科技大学青年教师创新基金(2016LG11)；天津市大学生创新创业训练计划项目(201710057094)

马 倩(1987—)，女，山东潍坊人，讲师，博士，研究方向为氨基酸发酵过程系统生物学分析，E-mail: qianma1987@tust.edu.cn. 通信作者：谢希贤教授，E-mail: xixianxie@tust.edu.cn.

TQ922

A

1674-2214(2017)03-0158-04