不同发酵菌对腐乳风味的影响

庄 洋,田盼盼,陈美林,单长海,莫开菊*

(1.湖北民族学院 生物科学与技术学院,湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院科技学院,湖北 恩施 445000；3.恩施州质量产品监督检验所,湖北 恩施 445000)

不同发酵菌对腐乳风味的影响

庄 洋1,田盼盼2,陈美林1,单长海3,莫开菊1*

(1.湖北民族学院 生物科学与技术学院,湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院科技学院,湖北 恩施 445000；3.恩施州质量产品监督检验所,湖北 恩施 445000)

腐乳风味成分含量丰富,气味浓郁,多地名优产品风味成分已有研究报道,但是尚未见关于发酵剂对腐乳风味成分的影响研究.使用3种毛霉菌纯种发酵,采用顶空固相微萃取技术检测不同菌种发酵结束和腌制后2个阶段的腐乳挥发性成分.结果表明在发酵结束时,腐乳毛胚的挥发性成分较少,主要成分是蛋白质的分解产物三甲胺、苯酚和吲哚；腌制后,腐乳成品挥发性成分更丰富,主要是添加辅料及其相互作用产生的风味成分.但是发酵菌对腐乳的风味有着显著的影响,不同霉菌发酵的毛坯和腐乳的主要风味成分和含量存在差异,且能用感官感知其差异性,其中以总状毛霉生产的腐乳风味浓郁.

腐乳；霉菌；气质联用；挥发性成分；风味

腐乳是我国的传统发酵食品,又称霉豆腐、豆腐乳、南乳,最早出现在我国西汉时期,后传至日本、韩国、越南、菲律宾、印度尼西亚、泰国等东南亚国家．在国外享有东方奶酪(Chinese cheese)的美称[1].腐乳种类繁多,按色泽风味可分为白腐乳、红腐乳、青腐乳等,生产菌种有毛霉、根霉、细菌或直接酶法发酵等[2].不同的发酵方法、不同的地域生产出来的腐乳风味都有较大差异,除了外界环境因素外,发酵菌种应该是一个非常重要的因素,因此本实验考虑研究发酵菌种对腐乳风味的影响.

近年来对腐乳的研究越来越多,如卢靖[3]、王越鹏[4]对腐乳发酵过程挥发性风味成分的变化进行了研究,表明不同发酵时期腐乳的风味成分有明显差异,并探索出几种对腐乳风味影响较大的化合物.Chung等[5-9]对不同品牌和不同品种的腐乳风味成分进行了研究,表明腐乳挥发性风味成分以酯类和醇类为主,还含有烃类、羧酸类、醛类、酮类、呋喃等物质.以上对腐乳发酵研究结果表明虽然不同的研究中腐乳的风味成分不尽相同,但产生的风味成分中酯类含量最多,且类种也最为丰富,是腐乳的第一风味物质,其次是醇类.虽然对腐乳的研究很多,但针对不同菌种对腐乳风味形成的影响研究却未见报道,所检索的文献均未说明是环境因素或是后期发酵添加物或是发酵菌种原因造成的差异.因此,本实验利用3种霉菌进行纯种发酵,采用顶空固相微萃取(HS-SPME)提取挥发性成分,结合气相色谱质谱联用仪(GC-MS)对腐乳发酵成品中的挥发性成分进行定性分析,研究菌种对腐乳发酵产生的风味的影响.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豆腐(市售),自制腐乳(发酵菌种为:1号,总状毛霉( Mucor racemosus) AS 3.2729；2号,五通桥毛霉(Mucor wutumgkiao) AS 3.25； 3号,腐乳毛霉(Mucor sufu))菌种均购自上海瑞楚生物公司,无水硫酸钠(分析纯,西亚试剂)

1.2 仪器与设备

5973/6890气相色谱 - 质谱联用仪(美国安捷伦公司)；HWS12恒温水浴锅(上海一恒有限公司)

1.3 实验方法

1.3.1 毛霉纯种发酵腐乳工艺(样品制备) 购买的市豆腐经紫外照射杀菌后分别接种霉菌进行发酵,发酵15天后得到毛胚,将毛胚浸入白酒中后取出放入装有一定比例的食盐、花椒、辣椒、生姜的盆中,将毛坯沾酒后裹上上述佐料后装入玻璃罐中,密封,进行后期腌制.

1.3.2 挥发性物质的提取 将待测样品研磨均匀,取2g样品加入到15 mL顶空萃取瓶中.密封后置于电热水浴锅中60 ℃预热5 min,将老化后的100 μmPDMS萃取头插入进样品顶空萃取.顶空吸附30 min后插入GC进样口解吸5 min.

1.3.3 分析条件 色谱条件:色谱柱DB-5MS(30 m*0.25 mm*0.25 μm)；进样口温度250 ℃；升温程序:起始温度50 ℃,保持1 min；然后以4 ℃/min的速率升温到185 ℃,保持1 min；最后以10 ℃/min的速率升温到250 ℃,保持1 min；载气(He)；流速1.0 mL/min.质谱条件:离子源温度230 ℃；接口温度250 ℃；电离方式:电子电离(electron ionization,EI)源；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z 33～440.

利用计算机NIST11谱库数据检索,各组分相对含量按峰面积归一法进行计算分析,分析出的化合物匹配度都大于80%.

1.3.4 风味评价 实验室7位人员对腌制好的腐乳风味进行评价.

2 结果分析与讨论

2.1 GC-MS鉴定腐乳挥发性成分

分别对不同时期不同菌种发酵的样品总离子流图(如图1和图2所示)进行数据分析和整理,鉴定出不同霉菌发酵腐乳不同时期的挥发性成分及相对含量,见表1～4.

图1 不同霉菌发酵腐乳毛胚挥发性成分气质联用分析总离子流色谱图Fig.1 GC-MS analysis of total ion flow chromatogram of volatile components of fermented bean curd fermented by different molds注:从上到下依次是总状毛霉、五通桥毛霉、腐乳毛霉发酵腐乳毛胚

图2 不同霉菌发酵后腌制成熟腐乳挥发性成分气质联用分析总离子流色谱图Fig.2 GC-MS analysis of total ion flow chromatogram of volatile components of pickled mature Sufu by different mold fermentation注:从上到下依次是总状毛霉、五通桥毛霉、腐乳毛霉腌制成熟腐乳

表1 不同霉菌发酵毛胚15天后测的挥发性化合物

表2 发酵15天毛胚挥发性化合物的种类及相对含量

2.1.1 毛胚风味成分分析 综合表1和表2可以看出霉菌发酵豆腐15天后毛胚,产生的风味成分很少,其共同点是霉菌使豆腐蛋白质分解产生的三甲胺、苯酚和吲哚等物质.三者的差别如下:1号腐乳毛胚和2号腐乳毛胚的风味物质基本相同,但含量比例不同,而3号腐乳毛胚,产生了2种脂肪酸和1种醇类物质.综合得出,1号毛霉和2号毛霉的发酵特征相似,主要作用于蛋白质的降解,对脂类物质的水解作用较弱;3号毛霉既能降解蛋白质,也能水解脂类,产生相应的脂肪酸.

与卢靖[3]、王越鹏[4]所做的腐乳毛胚风味成分比较发现,本实验所测得的风味成分明显偏少,这可能与发酵菌密切相关.卢靖、王越鹏均未说明使用的哪种毛霉菌种.本实验发现不同霉菌的腐乳毛胚风味成分有差异.3种腐乳毛胚中含量较高的主要风味物质都是三甲胺、苯酚、和吲哚,占了毛坯风味成分的一大半.含量最高是是三甲胺,其具有鱼腥恶臭,在水产品和肉类中研究较多[10-12],但是在有关腐乳风味成分的文献中均未见报道.只有杨娟[13]在“豆豉、腐乳蛋白质降解物限量标准研究”一文中测定了33种腐乳中的三甲胺,所有腐乳无一例外均含有,说明是腐乳中最常见的成分.由于三甲胺的挥发性和刺激性,无疑是腐乳的重要气味物质.本文检测出含量其次的是苯酚.苯酚也是腐乳风味中的重要物质,闫平平[7],孙菁赫[14],马艳莉[15]报道青方中含有苯酚,可能来源于酪氨酸的分解.此外,苯酚的同系物4-甲基苯酚[4],4-乙基苯酚[16]也有报道.在腐乳的挥发性成分检测中,吲哚是出现频度较高的物质[3、4、7、8、14、15],吲哚在浓度较高时具有强烈的粪便臭味,低浓度具有花香.吲哚可能由色氨酸裂解直接产生[4].腐乳毛坯中还含有醇、烃、酮、酯、酸等风味成分,但是本文检测到的种类和含量都较少.

2.1.2 腌制成熟腐乳风味成分分析

表3 不同菌种发酵腐乳并腌制后挥发性成分及其相对含量

续表3

序号保留时间/minCAS号中英文名称相对含量/%1．总状毛霉2．五通桥毛霉3．腐乳毛霉匹配度2911．789002244-16-8D(+)-Carvone右旋香芹酮0．701．701．49953012．069000089-81-61-methyl-4-isopropyl-1-cyclohexen-3-one胡椒酮3．293．846．84943112．906092618-89-8Aceticacid，1，7，7-trimethyl-bicyclo[2．2．1]hept-2-ol-ester1，7，7，三甲基-[2．2．1]二环庚烷-2-乙酸酯0．200．230．54983213．076000536-60-7Cuminylalcohol对异丙基苯甲醇0．33963313．237029050-33-74-Carene(7CI，8CI)4-蒈烯0．390．360．61873413．322000123-29-5Ethylnonanoate壬酸乙酯0．18963514．566000080-26-2Terpinylacetate乙酸松油酯2．974．224．99913615．625000515-13-9b-Elemen榄香烯0．400．850．85903715．895000110-38-3Ethylcaprate癸酸乙酯0．260．35943816．307000087-44-5l-Caryophyllene1-石竹烯0．380．780．48993916．623029873-99-2(-)-γ-Elemeneγ-榄香烯0．46984017．182006753-98-6α-Caryophylleneα-石竹烯0．39964117．286025246-27-91，1，7-Trimethyl-4-methylenedecahydro-1H-cyclopropa[e]azulene香树烯0．06974217．361150320-52-82-Isopropyl-5-methyl-9-methylene[4．4．0]dec-1-ene2-异丙基-5-甲基-9-亚甲基[4，4，0]-1-双环烯0．140．41944317．716030021-74-0γ-Muuroleneγ-衣兰油烯0．14984417．858000489-40-7α-Gurjuneneα古芸烯0．371．251．03954517．91000644-30-4Curcumene姜黄烯0．341．22994618．265000495-60-32-甲基-(1，5-二甲基-4-己烯基)-1，3-环己二烯0．651．031．15874718．568000495-61-4l-b-Bisabolenel-b-红没药烯0．370．680．67934818．766000483-76-1d-Cadinened-毕澄茄烯0．220．510．42994918．927020307-83-9(1，3-二甲基-4-烯-6-亚甲基)环己烯0．200．680．35955020．148001139-30-64，5-Epoxy-4，11，11-trimethyl-8-methylenebicyclo(7．2．0)undecane氧化石竹烯0．31955120．682000106-33-2Ethyllaurate月桂酸乙酯0．300．43945225．043000124-06-1Ethylmyristate肉豆蔻酸乙酯0．300．350．21975327．687000112-39-0Methylhexadecanoate棕榈酸甲酯0．150．55985428．581054546-22-49-Hexadecenoicacid，ethylester9-十六碳烯酸乙酯0．170．15995529．134000628-97-7Ethylpalmitate棕榈酸乙酯2．402．296．95985630．842000112-63-0Methyllinoleate亚油酸甲酯0．55995730．974001937-62-8Methyl9-(Z)-octadecenoate反-9-十八烯酸甲酯0．57995831．849007619-08-1Ethyllinoleate亚油酸乙酯2．872．122．11965931．953000111-62-6Ethyloleate油酸乙酯2．962．032．19996032．034006114-18-7(9E)-9-Octadecenoicacidethylester反油酸乙酯0．420．420．96986132．318000111-61-5Octadecanoicacid，ethylester硬脂酸乙酯0．120．09996232．4971000336-69-8Ethyl9．cis．，11．trans．-octadecadienoate9-顺-11-反-十八碳二烯乙酯0．18956332．611000544-35-49，12-Octadecadienoicacid(Z，Z)-，ethylester(Z，Z)-9，12-十八烷二烯酸乙酯0．0996

表4 不同菌种发酵腐乳并腌制后的挥发性化合物的种类及相对含量

由表3和表4可知,3种菌种发酵腐乳中共检测出63种挥发性风味物质,包括醇类,烃类,酯类,醛类等化合物.1号腐乳中检测出49种化合物,其中醇类10种(52.95%),烃类20种(22.56%),酯类16种(20.39%),酮类3种(4.10%)；其中相对含量较大的为桧烯(2.69%)、β-蒎烯(3.19%)、正己酸乙酯(6.32%)、α-萜品烯(2.81%)、桉叶油醇(29.53%)、萜品烯(3.99%)、反式-1甲基-4(1-甲基乙烯基)-环已醇(2.49%)、芳樟醇(4.61%)、4-萜烯醇(8.87%)、α-松油醇(2.07%)、胡椒酮(3.29%)、乙酸松油酯(2.97%)、棕榈酸乙酯(2.40%)、亚油酸乙酯(2.87%)、油酸乙酯(2.96%)等.

2号腐乳中检测出49种化合物,其中其中醇类10种(46.13%),烃类22种(30.95%),酯类14种(16.48%),酮类3种(5.75%)；其中含量较大的为桧烯(3.30%)、β-蒎烯(4.88%)、正己酸乙酯(3.50%)、α-萜品烯(2.66%)、桉叶油醇(28.61%)、α-蒎烯(2.23%)、萜品烯(5.42%)、芳樟醇(3.07%)、4-萜烯醇(8.35%)、胡椒酮(3.84%)、乙酸松油酯(4.22%)、棕榈酸乙酯(2.29%)、亚油酸乙酯(2.12%)、油酸乙酯(2.03%)等.

3号腐乳检测出43种化合物,其中醇类15种(57.07%),烃类13种(10.47%),酯类12种(21.3%),醛类3种(8.77%)；其中含量较大的为桉叶油醇(25.12%)、芳樟醇(5.16%)、4-萜烯醇(15.57%)、α-松油醇(4.03%)、胡椒酮(6.84%)、乙酸松油酯(4.99%)、棕榈酸乙酯(6.95%)、亚油酸乙酯(2.11%)、油酸乙酯(2.19%)等.

由表3和表4可知,1号和2号腐乳所含挥发性风味成分种类较多且比较接近,3号腐乳所含挥发性风味成分较少,与1号2号相比,无论是风味成分的种类还是含量都有较大差异.其主要差异是增加5种醇类,减少6～8种烃类.

在腐乳风味成分研究的文献中,酯类被公认为主要物质[ 3,4,8,17-19],本文也不例外.酯类大多数具有独特的气味,赋予食品香甜气味,被认为是腐乳粉及食品的香气主要成分[18-19].CHUNG等[14,16]认为硬脂酸乙酯、十六酸乙酯、亚麻酸乙酯等长链酯类物质是腐乳产生的主要风味物质,与本文中这些酯类物质含量较高相符,这些酯类物质大多具有较轻微的油脂味[20-21],虽然阈值较高,但含量丰富,在腐乳风味中占有较大比重.卢靖[3]和Yen-Yi Li[22]认为酯类的增加主要发生在加入酒精的腌制期,且产生的酯类含量与加入的酒精呈正相关.本实验使用纯种毛霉菌发酵,毛坯中未检测出乙醇,因此产生的酯类也在腌制期加入酒后产生.

醇类对腐乳的风味贡献也不容忽视,醇类具有较强烈的香味.腐乳中醇的种类和含量与外界添加有关,腌制时添加乙醇,腐乳中醇的种类和含量都会增加,使得腐乳中的香气更好丰富浓郁,且醇能与脂肪酸生成酯,合成了腐乳的主要风味物质.此外,香辛料的加入也大大丰富了腐乳醇类成分.花椒中含有大量的香气成分,其中主要含有桉叶油醇和4-萜烯醇等[11],本产品中含量最为丰富的桉叶油醇和4-萜烯醇等,可能来源于花椒.

腐乳中另一大类挥发性物质是烃类.在香气成分分析中,大部分[23-26]研究都表明酯和醇或醛是香气成分的主体,本实验腐乳风味的检测中检测到较高含量的烃类,且都是烯烃,一般来说烯烃的阈值较低度具有特殊香气[27-28],例如蒎烯有松节油的气味,异松油烯有松木树脂似的气息等.对腐乳的风味有一定的贡献.虽然腐乳发酵过程中也会产生烃类、醛类、酮类物质,但大部分此类物质是来源于花椒、姜、大蒜等其它香辛料[29-33].

综合表1～4,可以看出在腌制辅料加入后,腐乳的风味成分得到了极大的丰富.尽管大部分风味物质来自于腌制辅料及其所含成分之间的相互反应,但是不同菌种对风味成分仍然有着本质的影响.在本实验中所用的腌制辅料及用量是相同的,但是不同腐乳检测到的风味成分存在差异.腌制后,1号和2号腐乳的风味成分比较接近，3号腐乳的风味成分差异较大,这与毛胚情况一致.腌制后1号腐乳酯类最多；2号腐乳的酯类仅次于1号,烃类物质2号最多,1号次于2号；3号腐乳酯类、烃类物质最少,而醇类物质最多.说明1号产酯能力强,2号腐乳产烃类物质强,3号产醇的能力强.综上所述,不同霉菌菌种会导致腐乳风味成分的差异.

2.2 不同腐乳风味的感官差异

由于固相微萃取所测定的风味成分大体相同,并难以分辨3种腐乳风味差异,因此研究中以感官鉴评了解3种腐乳的总体风味差别,结果见表5.

表5 腌制成熟后腐乳风味评价

*参评者中有1人对3种产品都不喜欢.

由表5可见,不同霉菌发酵的腐乳在风味类型、浓淡和可接受度方面都是存在较大差异.1号总状毛霉发酵腐乳产生的香气最为浓郁,香气好,接受程度最高.2号五通桥毛霉发酵腐乳与1号总状毛霉发酵腐乳香气相似,但浓郁程度较弱.3号腐乳毛霉发酵腐乳带有较弱臭味,接受程度最低.感官评定结果与固相微萃取风味成分的差异性相吻合,同时也佐证了腐乳的主要风味成分是酯类,其次是醇类,烃类的贡献较弱.

3 结论

本研究以总状毛霉、五通桥毛霉、腐乳毛霉3种毛霉发酵腐乳,并采用顶空固相微萃取法结合气相色谱-质谱联用法检测样品挥发性风味成分,共检定出76种挥发性化合物,包括醇类、烯烃、酯类、酮类,酸类等.发酵菌对腐乳风味存在显著影响,以总状毛霉生产的腐乳风味浓郁,香气好.

在发酵阶段,主要是在霉菌产生的蛋白酶作用下分解蛋白质,产生了三甲氨、苯酚、吲哚等物质,其它物质的种类和含量都很少.腐乳腌制的过程中由酒和辅料产生了更多的风味物质,以酯类、醇类和烃类为主,此外还含有少量的醛、酮、醌、酸等.虽然仪器检测的腐乳风味成分以外源添加为主,但是在添加辅料完全一致的情况下,不同霉菌发酵的毛坯和产品中的风味成分仍然存在种类和含量上的差异,且感官能感知总体风味的区别,仪器测定和感官鉴评结果相一致,说明菌种对腐乳的风味产生明显的影响.

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责任编辑：高 山

Effects of Different Fermented Bacteria on Flavor of Sufu

ZHUANG Yang1,TIAN Panpan2,CHEN Meilin1,SHAN Changhai3,MO Kaiju1*

(1.School of Biological Science and Technology,Hubei University for Nationalities,Enshi 445000,China; 2.Science and Technology College of Hubei University for Nationalities,Enshi 445000,China; 3.Enshi Quality Supervision and Inspection Institute,Enshi 445000,China)

Sufu (fermented tofu) is rich in flavor components and it has strong smell.Studies on the flavor components of multiple geographical brand-name and high-quality products have been reported.However,the efferct of starter on the flavor components of Sufu has not been studied.In this paper,3 kinds of Mucor are used for fermentation,and head-space solid phase microextraction (HS-SPME) is used to test the volatile flavor components in different strains after fermentation and pickled tofu of the two period.The results show that at the end of fermentation the fermented bean curd has less volatile components,the major components are protein decomposition products such as trimethylamine,phenol and indole.After curing,the volatile components of pickled are more abundant,mainly flavor components is adding auxiliary materials and their produced by interaction.But the fermented bacteria had a significant influence on the flavor of sufu.The main flavor components and contents of fermented and pickled Sufu were different and we can sense the difference.Among them pickled tofu by Mucor racemosus has the richest flavor.

Sufu;mold;GC-MS;volatile components;flavor

2017-05-20.

恩施州科学技术局项目(恩施科业[2014]18号)

庄洋(1990-),男,硕士生,主要从事林特食品加工的研究;*

莫开菊(1965-),博士,教授,主要从事食品加工及资源开发的研究.

1008-8423(2017)03-0270-08

10.13501/j.cnki.42-1569/n.2017.09.006

TS264.2

A