利鲁唑对戊四氮致癫痫大鼠海马CA3区IL-1β、TNF-α的影响

2017-09-12冯基高莫业和刘达远王东军

海南医学 2017年16期

关键词：谷氨酸阳性细胞海马

冯基高，莫业和，刘达远，王东军

（1.海南医学院第二附属医院神经外科，海南海口570311；2.广东医科大学，广东湛江524001）

利鲁唑对戊四氮致癫痫大鼠海马CA3区IL-1β、TNF-α的影响

冯基高1，莫业和1，刘达远1，王东军2

（1.海南医学院第二附属医院神经外科，海南海口570311；2.广东医科大学，广东湛江524001）

目的探讨利鲁唑对戊四氮(PTZ)致癫痫大鼠海马CA3区白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)的影响。方法将45只大鼠按完全随机设计方法分为对照组、癫痫模型组(PTZ组)和利鲁唑组（Riluzole组)，每组15只；造模大鼠连续给予PTZ(35 mg·kg-1·d-1)腹腔注射30 d，3次Ⅳ级或以上发作大鼠为癫痫造模成功；免疫组织化学法检测各组大鼠海马CA3区IL-1β、TNF-α的表达和分布。结果对照组、PTZ组及Riluzole组大鼠的IL-1β阳性细胞平均光密度值(OD)分别为(0.210±0.002)、(0.241±0.002)和(0.220±0.002)，不同组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05)；TNF-α阳性细胞OD值分别为(0.191±0.003)、(0.230±0.003)和(0.202±0.003)，不同组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05)；大鼠海马CA3区IL-1β与TNF-α表达水平呈显著正相关(r=0.969，P＜0.01)。结论利鲁唑通过抑制癫痫大鼠脑内神经细胞过度表达IL-1β、TNF-α，可能降低其对正常神经细胞的损伤作用，可能减缓癫痫发病对正常神经细胞的损伤，产生神经保护作用。

大鼠；利鲁唑；戊四氮；癫痫；白细胞介素1β；肿瘤坏死因子α

癫痫是临床最常见的神经系统疾病之一。免疫-神经-内分泌网络调节失衡与癫痫的发病密切相关[1]。细胞因子白细胞介素1β(interleukin-1 beta，IL-1β)及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)均是体内重要的免疫调节因子，在中枢神经系统中还发挥着神经递质的重要作用，它们与其受体紧密相结合后，通过调节神经元释放神经递质并影响神经元活性等重要相关途径干扰癫痫的发生发展。利鲁唑属苯噻唑类化合物，是临床上用于治疗运动神经元病的一种药物。其通过抑制脑内兴奋性氨基酸的活性、抑制N-甲基-D-天门冬氨酸受体(N-Methyl-D-Aspartate Receptor，NMDAR)的功能、抑制兴奋性神经递质的释放及稳定电压依赖性钠通道的失活状态等机制来产生神经保护作用[2]。有关载体状况下利鲁唑对癫痫模型海马组织IL-1β、TNF-α的影响鲜见报道。鉴于此，本研究拟通过腹腔注射利鲁唑观察其对戊四氮(pentylenetetrazol，PTZ)致癫痫大鼠海马组织IL-1β、TNF-α表达的影响，以期为临床上预防及治疗癫痫疾病提供实验支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物雄性健康SD大鼠60只，体质量(200±20)g，由广东医学院实验动物中心提供。

1.2 主要试剂利鲁唑片购自赛诺菲(北京)制药有限公司(国药准字J20100164，规格：50 mg)；PTZ购自美国Sigma公司；兔抗鼠IL-1β单抗、兔抗鼠TNF-α单抗购自武汉博士德生物公司；二步法免疫组化检测试剂、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物公司。

1.3 动物分组实验SD大鼠分笼饲养于动物房中，26℃恒温，采用自由进食水、自然昼夜的方法饲养，注意避免非特异性应激反应的发生。实验前适应性喂养7 d，将45只大鼠按完全随机设计方法分为对照组、癫痫模型组(PTZ组)和利鲁唑组(Riluzole组)，每组15只。

1.4 造模方法造模大鼠按35 mg·kg-1·d-1给予PTZ腹腔注射，连续30 d。注药操作在每天上午8:00～9:00进行。每次给药后观察大鼠30 min，并记录癫痫发作潜伏期、发作持续时间及发作时的行为表现。大鼠每5～6 d称体质量一次，以便调整PTZ剂量。模型点燃成功后，每5 d腹腔注射PTZ溶液1次加以巩固。

1.5 癫痫发作的分级大鼠癫痫的行为表现采用Racine六级评价标准[3]。0级：无任何反应；Ⅰ级：湿狗样抖动表现为节律性咀嚼、动须及眨眼；Ⅱ级：颈部肌肉持续痉挛表现为甩尾和(或)点头；Ⅲ级：一侧前肢间断性阵挛；Ⅳ级：双侧前肢间断性阵挛伴站立；Ⅴ级：全身阵挛，跌倒。记录癫痫发作持续时间及发作时的行为表现。凡已获得连续3次Ⅳ级或以上发作者，被认为完全点燃。

1.6 利鲁唑大鼠给药剂量、给药途径及时间采用灌胃法给药：造模成功后，利鲁唑组按10 mg·kg-1·d-1给予利鲁唑溶液灌胃，灌胃操作在每天上午8：00～9：00进行，连续给药8周。对照组和PTZ组给予等体积蒸馏水灌胃。

1.7 标本的处理及切片的制备在最后一次灌胃给药24 h后，10%的水合氯醛麻醉大鼠，断头处死，在冰盒上快速开颅取脑，分离脑组织取海马组织，置于4%多聚甲醛溶液中，4℃存放24 h。梯度酒精脱水后石蜡包埋。石蜡标本常规5 μm连续切片，取含海马组织最大、最完整切面的切片供免疫组织化学反应。

1.8 免疫组织化学染色选取的石蜡切片经烤片、二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水后高压修复抗原，加3%H2O2灭活内源性过氧化物酶，滴加一抗湿盒内4℃孵育过夜后滴加二抗，DAB显色、苏木素复染、1%盐酸酒精分化、氨水返蓝、梯度酒精脱水最后封片。

1.9 染色结果的判断IL-1β、TNF-α的表达均以胞浆有棕黄色着色为阳性。采用图像分析系统(OLYMPUS BX500显微镜，电脑图像采图软件Image-Pro Plus 6.0分析软件)进行图像分析。每只大鼠取5张切片，测海马组织CA3区，在200倍视野下获取平均光密度(OD)值，最后数据由分析系统自动计算。

1.10 统计学方法应用SPSS20.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差()表示，计量资料两两比较采用t检验，检验水准α=0.05，相关性分析采用Spearman相关分析法。

2 结果

2.1 行为学观察空白组无抽搐发作。45只腹腔注射PTZ溶液的SD大鼠，第1周后19只出现Ⅲ级以上发作，表现为点头甩尾，四肢阵挛，之后癫痫发作逐渐加重。第2周后24只达到Ⅳ～Ⅴ级发作，表现为头颈部僵硬，前肢阵挛，后肢直立，站立不稳，跌倒，1只有Ⅴ级发作并死亡。第3周后34只大鼠达到Ⅳ～Ⅴ级发作，2只有Ⅴ级发作并死亡。第4周后36只达到Ⅳ～Ⅴ级发作，达到Ⅴ级的有34只，占致癫痫大鼠的75.6%左右，表现为全身强直阵挛，站立不稳，跌倒，见表1。

表1 PTZ致癫痫大鼠模型行为学观察(只)

2.2 IL-1β免疫组织化学结果光镜下观察免疫组织化学染色后的大鼠海马组织CA3区，IL-1β呈胞浆表达，阳性细胞胞浆呈棕黄色。三组两两比较，PTZ组、Riluzole组IL-1β阳性细胞表达显著高于对照组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；PTZ组IL-1β阳性细胞表达高于Riluzole组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见表2、图1～3。

表2 各组大鼠海马组织CA3区IL-1β的OD值()

注：与正常对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.05；与PTZ组比较，cP＜0.05。

对照组PTZ组Riluzole组0.210±0.002 0.241±0.002a0.220±0.002bc15 15 15

2.3 TNF-α免疫组织化学结果光镜下观察免疫组织化学染色后的大鼠海马组织CA3区，TNF-α呈胞浆表达，阳性细胞胞浆呈棕黄色。三组两两比较，PTZ组、Riluzole组TNF-α阳性细胞表达显著高于对照组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；PTZ组TNF-α阳性细胞表达高于Riluzole组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见表3、图4～6。

图1 对照组海马CA3区IL-1β免疫组化标记(×400)；图2PTZ组海马CA3区IL-1β免疫组化标记(×400)；图3利鲁唑组海马CA3区IL-1β免疫组化标记(×400)

2.4 IL-1β与TNF-α表达的相关性实验结果表明：大鼠海马CA3区IL-1β与TNF-α表达水平呈显著正相关(n=45，r=0.969，P＜0.01)，见图7。

表3 各组大鼠海马组织CA3区TNF-α的OD值()

注：与对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.05；与PTZ组比较，cP＜0.05。

组别对照组PTZ组Riluzole组TNF-α(OD) 0.191±0.003 0.230±0.003a0.202±0.003bc样本数（只）15 15 15

图4 对照组海马CA3区TNF-α免疫组化标记(×400)；图5PTZ组海马CA3区TNF-α免疫组化标记(×400)；图6Riluzole组海马CA3区TNF-α免疫组化标记(×400)

图7 各组SD大鼠海马CA3区IL-1β与TNF-α表达水平的关系(n=45)

3 讨论

IL-1β是一种多功能调节细胞因子，参与机体的多种病理生理反应。研究发现在癫痫大鼠模型脑组织中IL-1β的表达明显增高，癫痫患血清及脑脊液中IL-1β的含量也显著增高等[4-5]。Straussberg等[6]报道，IL-lβ可能通过介导细胞炎症参与癫痫发生。在脑内IL-β是由神经元和胶质细胞产生，与受体紧密相结合后，通过调节神经元释放神经递质并影响神经元活性等重要相关途径干扰癫痫的发生发展。TNF-α是一种具有多种生物学效应的细胞因子，有增强兴奋性神经介质兴奋毒性作用，参与多种疾病的病理生理过程，在癫痫中也有重要作用[7]。在癫痫患者脑组织和脑脊液中，TNF-α及TNF-α mRNA的表达明显升高[8]。Plata-Salaman等[9]发现，癫痫小鼠模型海马组织TNF-α mRNA表达水平明显升高。Liu等[10]发现癫痫与免疫功能异常关系密切，并发现TNF-α参与癫痫的发生发展。本实验也发现，癫痫大鼠模型海马组织IL-1 β、TNF-α阳性细胞表达显著增高[(0.241± 0.002)、(0.230±0.003)]；且IL-1β与TNF-α表达水平呈显著正相关(n=45，r=0.969，P＜0.01)。实验结果表明TNF-α与IL-1β关系密切，文献也报道IL-1β可激活核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)系统，NF-κB又能诱导TNF-α等更多细胞因子的表达[11]；而TNF-α可使星形胶质细胞活化增殖，诱导其合成和分泌IL-1、IL-2等细胞因子[12]，介导癫痫模型大鼠脑组织局部的炎症反应，加重神经损伤。

利鲁唑(Riluzole)属苯噻唑类化合物，能透过血脑屏障，临床上用于治疗神经损伤及退行性疾病。利鲁唑通过抑制NMDAR的功能及谷氨酸神经兴奋毒性作用机制，在麻醉、神经保护、抗惊厥、抗抑郁、镇痛和抗依赖等方面发挥作用[13]。研究表明，利鲁唑重要从突触前、突触间隙及突触后受体三个方面拮抗谷氨酸兴奋毒性作用发挥神经保护作用[14]，其作用机制可能与其影响多种离子通道和受体的功能相关。利鲁唑抑制中枢神经系统突触前释放谷氨酸[15]；上调星形胶质细胞谷氨酸转运体数量及活性，增加谷氨酸清除[16]。利鲁唑可抑制兴奋性氨基酸活性，从而减少脑组织中乙酰胆碱的释放，达到抗惊厥作用[17]。

结合本实验中利鲁唑组IL-1β及TNF-α阳性细胞表达均明显低于PTZ组(P＜0.05)的结果推测，临床上应用利鲁唑治疗癫痫疾病，可能会通过抑制谷氨酸的活性及释放，降低了谷氨酸调节星形胶质细胞的活化增殖作用，减少了神经胶质瘢痕的形成和胶质膜的重建，维持正常的生理结构及生理功能，从而产生神经保护作用影响癫痫的发生发展。而且，利鲁唑还可能会通过抑制脑内谷氨酸的活性及释放，间接抑制星形胶质细胞过度分泌IL-1β、TNF-α等重要细胞因子，降低IL-1β、TNF-α对正常神经细胞的损伤作用，从而减缓癫痫发病对正常神经细胞的损伤，产生神经保护作用。再者，利鲁唑可能会通过抑制了NMDAR的功能，间接抑制了IL-1β介导的神经元内钙离子升高，继而影响神经细胞膜上的电压门控通道，进而抑制神经元兴奋性增高及过度异常放电，最终抑制癫痫的发作。这些均需要后续实验去证实，这也提示了本实验为利鲁唑的研究提供新的方向。

综上所述，可以确认在癫痫中利鲁唑可抑制IL-1β、TNF-α的过度表达，可能发挥一定的神经细胞保护作用。但其机制仍需继续深入研究，在下一步研究中，我们将进行利鲁唑影响免疫系统通路的研究，阐明利鲁唑在癫痫发生发展中的具体机制，为癫痫的临床诊治及基础研究提供新的依据。

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Effects of riluzole on the expressions of IL-1β and TNF-α in the hippocampus CA3 of rat with seizures induced by pentylenetrazole.

FENG Ji-gao1,MO Ye-he1,LIU Da-yuan1,WANG Dong-jun2.1.Department of Neurosurgery,the Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570311,Hainan,CHINA;2.Guangdong Medical University,Zhanjiang 524001,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effects of riluzole on interleukin-1 beta(IL-1β)and tumor necrosis factor alpha(TNF-α)levels in the hippocampus CA3 of Rat,using pentylenetetrazole(PTZ)kindling epileptic model. MethodsA total of 45 rats were divided into 3 groups:the control group,the epilepsy model group(PTZ group)and the riluzole group according to the completely randomized design method,with 15 rats in each group.The model rats were continuously given PTZ(35 mg·kg-1·d-1)intraperitoneal injection for 30 days.Rats with 3 times ofⅣor more seizures were successfully modeled for epilepsy.The expressions and distributions of IL-1β and TNF-α of each group in hippocampus of CA3 were evaluated by immunohistochemical assay.ResultsThe mean optical density(OD)of IL-1β positive cells in the control group,PTZ group and riluzole group were(0.210±0.002),(0.241±0.002)and(0.220±0.002), respectively,and there were significant differences among them(P＜0.05).The mean optical density(OD)of TNF-α in the control group,PTZ group and riluzole group were(0.191±0.003),(0.230±0.003)and(0.202±0.003),respectively, and there were significant differences among them(P＜0.05).There was a significantly positive correlation between the expressions of IL-1β and TNF-α in hippocampus CA3(r=0.969,P＜0.01).ConclusionRiluzole prevent the excessive expression of IL-1β,TNF-α from neurons in the brain of epileptic rats,reduce its damaging effects on normal nerve cells.Therefore,Riluzole act as a neuroprotector to alleviate damages of epilepsy.

Rat;Riluzole;Pentylenetetrazole;Epilepsy;Interleukin-1 beta(IL-1β);Tumor necrosis factor alpha(TNF-α)

R-332

1003—6350（2017）16—2586—04