一株抗白叶枯病菌的嗜温菌的代谢物组成分析*

张 君， 张 静， 张 晓， 樊凌志， 孙梅好， 巩菊芳， 蒲首丞

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

一株抗白叶枯病菌的嗜温菌的代谢物组成分析*

张 君， 张 静， 张 晓， 樊凌志， 孙梅好， 巩菊芳， 蒲首丞

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

为分析抑制白叶枯病菌生长的嗜温芽孢杆菌(TH07)的代谢产物组成成分，对TH07的生长条件进行了优化，并利用红外光谱与核磁共振氢谱分析了TH07代谢产物乙酸乙酯萃取物.基于响应面方法的优化，得到了该菌的最佳生长条件：初始培养基pH为9，1 000 mL锥形瓶装液量为381 mL，接种量为6.37%(体积比).在上述条件下培养TH07，用乙酸乙酯萃取得到该菌的代谢产物，红外光谱与核磁共振氢谱对粗提物的分析结果表明：粗提物里含有小肽类物质、芳香族化合物或乙酰胺的芳香族化合物，可能是这些化合物参与了抑制白叶枯菌的生长.

响应面优化；白叶枯病菌；嗜温芽孢杆菌；抑菌活性

水稻白叶枯病是一直以来影响水稻产量的主要病害之一，该病害分布范围广泛，危害严重.目前，水稻白叶枯病已危及到了世界各个水稻生产地，其中南亚和东南亚的水稻受害最为严重[1].水稻一旦感染该病菌,将会导致20%～40%[2]的产量损失.作为水稻病害主要的防治措施，化学防治仍旧存在诸多弊端，化学农药的大量使用不仅对人体健康造成很大的危害，也会严重地污染环境，长期使用还会导致病原菌产生耐药性.微生物防治因其成本低、污染小、效果持久稳定[3-4]而被广泛应用到植物病害的防治中.因此，从自然界中寻找抗水稻白叶枯病的菌株已是植物保护方面的研究热点之一，具有重大的意义[5-6].

本实验室已在前期通过高温筛选从土壤中得到了一株嗜热芽孢杆菌TH07，实验证明，TH07的乙酸乙酯粗提物对白叶枯病菌具有明显的抑制作用.为了进一步研究TH07抑制白叶枯菌生长的具体的活性成分，本文做了大量的前期工作.首先，利用响应面方法优化了TH07的生长条件，提高菌株的生长量，以便后期更好地研究其抗菌物质；另外，借助红外光谱与核磁共振氢谱技术对TH07的代谢物成分进行了初步的分析，为后期继续分离鉴定TH07的有效活性成分奠定了一定的基础.

1 材料与方法

1.1 供试细菌

供试生防菌：嗜热芽孢杆菌(TH07)，自行分离于浙江师范大学校区土壤，于本实验室-80 ℃冰箱保存.

供试病原菌：水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)为菲律宾6号小种(PR6)，本实验室提供，保存在-80 ℃冰箱中.

1.2 培养基

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂 15～20 g，蒸馏水1 000 mL，自然 pH，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min.

NA培养基：胰蛋白胨5 g，酵母提取物1 g，蔗糖10 g，牛肉膏3 g，琼脂10 g，蒸馏水1 000 mL，自然 pH，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min.

1.3 实验仪器与设备

红外光谱仪(NEXUS 智能傅里叶，美国尼高力公司)；核磁共振波谱仪(NMR AV600，瑞士布鲁克公司).

1.4 滤纸片法

参照文献[7].

实验中采用滤纸片方法测试TH07的乙酸乙酯粗提物(甲醇溶解，50 mg/mL)对白叶枯菌的抑菌圈直径大小，所用的直径为5 mm滤纸片已进行灭菌处理，每个平板均匀放置3个滤纸片，其中2片浸入药液，另一片浸入甲醇作为对照.具体操作如下：

吸取0.2 mL白叶枯菌液(A600=0.75)，均匀涂布到NA培养基平板上；用无菌镊子夹取浸入药液和甲醇的滤纸片均匀贴在涂有菌液的平板培养基上；将平板置于28 ℃恒温培养箱中培养24 h后记录分析结果，用十字交叉法测量抑菌圈直径大小(含滤纸片直径5 mm).实验分3组并重复3次取平均值.

1.5 试管二倍梯度稀释法

对照文献[8-9].

取已灭菌的试管若干，从1开始编号.向1号试管中加入10 mL NA培养基，向另外5支试管里加入5 mL NA培养基；再向1号试管中加入0.02 g TH07乙酸乙酯萃取物，充分混匀；按照二倍稀释的方法，从1号试管中吸取5 mL液体加于2号试管中，充分混匀，依次进行，第5号试管中取出的5 mL液体弃去，6号试管为空白对照；向上述6支试管中分别接入100 μL已稀释的白叶枯菌的菌液，28 ℃培养16 h，观察现象，记录澄清无菌生长的药液浓度即为最小抑菌浓度，测定所有试管中的液体在600 nm波长处的吸光度值.

1.6 红外光谱法[10-11]

将乙酸乙酯萃取得到的TH07代谢粗提物放在真空干燥箱中50 ℃干燥至恒重，冷却到室温后备用.KBr压片制样:取样品10 mg研磨成2 μm以下的粉末后均匀分散到KBr中，用压片机制成薄片.开始测试，分别进行背景采集和样品信息采集，条件：4 cm-1的分辨率，400～4 000 cm-1范围内室温下扫描16次.

1.7 单因素实验设计

影响TH07菌株生长的因素很多，在进行响应面实验设计前选取3个对该菌生长影响相对较大的因素，分别为起始pH、接种量和装液量.

按照体积比为1%，2%，3%，4%，5%，6%和7%的接种比例，将TH07菌液接种到500 mL的LB液体培养基中，55 ℃ 摇床培养36 h，之后于波长600 nm处测定吸光度值.

以1%的接种量接种TH07到500 mL LB液体培养基中，实验前已经调节不同的pH(7.0，8.0，8.5和9.0)，于55 ℃摇床培养36 h后测吸光度A600.

以1%接种量接种TH07菌液分别于100，200，300，400和500 mL LB培养基中，保证相同的pH，同样55 ℃摇床培养36 h后测吸光度A600.

以上所有实验均在1 000 mL的摇瓶中培养，实验均重复3次后取平均值.

1.8 响应面实验设计

通过单因素实验确定出起始pH、接种量和装液量3个因素的合适的取值范围，再根据Box-Behnken中心组合实验设计原理，以起始pH、装液量和接种量为自变量，以TH07的吸光度为响应值，设计三因素三水平的中心组合实验，拟合自变量与响应值之间的模型方程[12].

2 结果与分析

2.1 抑菌实验

图1为TH07乙酸乙酯粗提物对水稻白叶枯菌的抑菌实验结果.从图1(a)可以看出，图片上方2个浸入药液的滤纸片周围无菌生长，图片下方浸入甲醇的滤纸片周围长满菌.可见，TH07粗提物对白叶枯菌有明显的抑制作用，通过十字交叉法测量了3组实验的平均抑菌圈直径达到(17.800±0.350) mm(含滤纸片直径5 mm).图1(b)显示了试管二倍稀释法的结果，随着药液浓度的增大，菌体浓度呈现明显下降的趋势，加入药液的浓度为1.00 mg/mL时，试管里的液体是完全澄清的，3次结果基本一致，通过分光光度计测得A600平均值为0.043 0±0.001 8，基本上没有白叶枯菌生长，此时的浓度即为最小抑菌浓度.

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图1 TH07代谢物对白叶枯菌的抑菌实验

2.2 单因素条件实验

图2～图4是单因素条件对TH07生长的影响.分析各图，选择最高点作为响应面设计点，最

终确定为pH 8.5，装液量300 mL，接种量6%，在这3个条件下,A600分别为 0.703 0±0.006 5，0.504 0±0.003 4和0.722 0±0.000 7，达到最大.

图2 装液量对菌株TH07生长的影响

图3 起始pH对TH07生长的影响

图4 接种量对菌株TH07生长的影响

2.3 响应面实验

2.3.1 响应面因素与水平

通过以上单因素实验，确定了起始pH、接种量和装液量这3个因素的水平范围，应用Box-Behnken模型设计三因素三水平实验，实验因素与水平的设计如表1所示.

2.3.2 Box-Behnken实验

实验共分17组，其中包括12个析因点、5个中心点的重复实验，以TH07的A600为响应值[13].实验设计方案与结果见表2.

表1 响应面实验因素水平及编码

表2 Box-Behnken实验设计与结果

表3 响应面实验结果的方差分析

2.3.3 回归模型与显著性

利用Design Expert 8.0.6.1对表3中实验数据进行了分析，模拟出TH07的A600对起始pH、装液量和接种量的多元二次回归方程模型：

A600= 0.64+0.009 5A+0.008 125B+

0.078C+0.006AB+0.011AC+

0.003 25BC-0.022A2-

0.008 625B2+0.064C2.

其中:A为pH;B为装液量;C为接种量.

响应面的二次模型方差分析结果如表3所示，P与F值表明该模型是高度显著的(P<0.000 1).R2为99.18%，表明该模型可以解释总变异的99.18%，调整后的决定系数R2Adj为98.12%，也足以证明模型有很高的拟合度[14].表3中模型失拟项P值为0.225 0，大于0.05，模型的失拟项不显著，说明该模型较准确[15].

分析回归方程系数的显著性可知:一次项A,B和C均显著;二次项A2和C2显著，B2不显著;交互项AB，AC和BC均不显著[16].方差分析表明，影响菌株生长的显著性因素是：接种量>初始pH>装液量.

2.3.4 优化结果与验证

为了得到最大的TH07菌株生长量，笔者采用Design-Expert里的Box-Behnken模型进行了响应面优化实验，得到了最佳组合条件：装液量为381 mL，接种量为6.37%，pH为9.模型预测的响应值为0.789，结果比之前提高了22.52%.上述显著性分析已证明该模型是显著的.为了确认模拟结果的准确性，本实验又做了验证实验，在优化的最佳条件下，55 ℃培养36 h后测吸光度值，实验重复3次得到的平均值为0.803，相对误差为1.77%，说明实验值与预测值拟合良好，结果是可信的.所以，上述优化模型适用于TH07菌株的实验室摇瓶培养[17].

2.4 TH07代谢产物的组成成分分析

图5 TH07代谢物的红外光谱

图6 TH07代谢物的二阶红外导数光谱

TH07代谢物的核磁共振氢谱(CD3OD,600 MHz)显示：高场处主要是甲基、亚甲基和次亚甲基的氢信号，化学位移在3.8～4.8,说明化合物中含有强吸电子的原子或基团；低场区出现的几组峰δH：7.423(d，J=7.8 Hz)，7.309(m，J=7.2 Hz)，7.262(d，J=7.2 Hz)，7.211(q，J=3.6，7.8 Hz)，7.061(d，J=8.4 Hz)，6.998(d，J=8.4 Hz)，6.726(d，J=8.4 Hz).从耦合常数、氢的化学位移和各组峰的面积积分比进一步证实,该粗提物中含有多个芳香族化合物.

综合上述红外光谱与核磁共振谱的分析结果，推测TH07代谢物中可能含有乙酰氨基的小肽类物质、芳香族化合物或乙酰胺的芳香族化合物.

3 结 论

总结以上的分析，推测可能是上述这些化合物参与了抑制白叶枯菌的生长.今后的工作是借助各种分离鉴定方法进一步探索分析TH07代谢产物抗白叶枯病菌的有效成分.

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(责任编辑 薛 荣)

Composition analysis of metabolites from antagonistic thermophilic bacteria againstXanthomonasoryzaepv.oryzae

ZHANG Jun, ZHANG Jing, ZHANG Xiao, FAN Lingzhi, SUN Meihao, GONG Jufang, PU Shoucheng

(CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China)

In order to analyze the composition of the metabolites from antagonistic thermophilic bacteria TH07 againstXanthomonasoryzaepv.oryzae, growth conditions for TH07 was optimized, secreted metabolites extracted by ethyl acetate were analyzed by Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and1H NMR. Based on optimization of response surface methodology, the optimum fermentation conditions for TH07 were obtained as following: initial medium pH = 9, medium volume of 381 mL with one liter conical flasks, and inoculums size of 6.37% (V/V), respectively. Using the optimized conditions to culture TH07, secreted metabolites were extracted by ethyl acetate, and crude extracts were further analyzed by FTIR spectrum and1H NMR. The results showed that the crude extraction contained small peptides, aromatic compounds or acetamide aromatic compounds, which suggested that these compounds may be involved in inhibiting growth ofXanthomonasoryzaepv.oryzae.

response surface optimization；Xanthomonasoryzaepv.oryzae； TH07; antibacterial activity

10.16218/j.issn.1001-5051.2017.03.012

�2016-11-09；

2016-12-22

浙江省重中之重学科“生物学”开放基金资助项目(KFJJ2014002)

张 君(1991-)，女，安徽六安人，硕士研究生.研究方向：生物小分子.

蒲首丞.E-mail: pu2002@126.com>

Q93

A

1001-5051(2017)03-0318-06