多年生稻白叶枯病抗性评价

李鹏林 秦世雯 张石来 黄光福 张静 吕建平 胡凤益*

（1 云南大学农学院/云南省多年生稻工程技术研究中心，昆明 650504；2 云南省植保植检站，昆明 650034；第一作者：lipenglin@mail.ynu.edu.cn；*通讯作者：hfengyi@ynu.edu.cn）

多年生稻是指种植一次可以连续收获多年（季）的水稻，即从第2年（季）起不再需要买种、育秧、犁田耙田、栽秧等生产环节，大大减少了劳动力投入和减轻了劳动强度，是一项轻简化的稻作生产技术。该项技术包括了多年生稻品种及配套的耕作栽培技术[1-2]。近年来，云南大学已成功利用长雄野生稻（Oryza longistaminata）地下茎无性繁殖特性培育出多年生稻品种[1-3]。其中，多年生稻23（PR23）已通过云南省审定（审定编号：滇审稻2018033号），云大24（PR24）、云大25（PR25）、云大101（PR101）、云大107（PR107）等品系也开始试验试种。通过前期在云南省内多年多点试验结果来看，尽管多年生稻品种（系）的父本长雄野生稻携带有水稻白叶枯病抗性基因Xa21[4-5]，但多年生稻品种（系）在各地的白叶枯抗性表现不一。多年生稻品种（系）是否具备白叶枯病抗性并携带相关抗病基因并不十分清楚，导致在多年生稻抗白叶枯病育种和生产应用上指导性不强。

因此，本研究通过田间病情调查、人工接种抗性水平鉴定和抗性基因检测3种方法，对多年生稻品种（系）PR23、PR24、PR25、PR101、PR107及其亲本长雄野生稻、RD23和F1（RD23/长雄野生稻）进行白叶枯病抗性鉴定，以明确多年生稻品种（系）的白叶枯病抗性水平，为今后多年生稻遗传育种、生产防控，以及产业布局提供一定科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以PR23、PR24、PR25、PR101、PR107、长雄野生稻（多年生稻的父本）、RD23（多年生稻的母本）、F1（RD23/长雄野生稻）共计8个材料进行白叶枯病抗性鉴定。其中，长雄野生稻来源于非洲尼日尔，RD23是泰国优质籼稻，杂交后通过幼胚挽救技术获得了F1植株，经过多世代的自交，选育出PR23、PR24、PR25、PR101、PR107等多年生稻品种（系）。

1.2 试验地点

试验材料于2019年种植于西双版纳州多年生稻育种基地，海拔为580 m，年平均气温22.6 ℃，年降水量1 200 mm。西双版纳州气候高温高湿，水稻生产易感染白叶枯病。田间调查在西双版纳傣族自治州示范推广田块进行。

1.3 田间管理

接种用品种（系）7月15日播种，8月5日移栽大田，每个品种栽4行，移栽行株距为20 cm×20 cm，单苗移栽，每行10株。示范田早稻播种期为1月15日，移栽期为3月1日，晚稻播种期和移栽期与接种用品种一致，移栽行株距为20 cm×20 cm，每丛栽1～2苗。接种田和示范田田间水肥管理参照当地大面积水稻生产田。

表1 水稻白叶枯病分级和评价标准

1.4 白叶枯病抗性鉴定

1.4.1 田间病情调查

6月、10月对西双版纳州试验田及示范推广田块的PR23、PR24、PR25、PR101、PR107，以及长雄野生稻、RD23和F1（RD23/长雄野生稻）进行早稻和晚稻的田间白叶枯病病情调查，采用五点取样调查法，病级评价参照已有标准[6]（表1）。

1.4.2 田间接种鉴定

选取9个不同致病力的水稻白叶枯病生理小种用于抗性水平鉴定，即YP1、YP2、YP3、YP4、YP5、YP6、YP7、YP8、YP9菌株（由云南农业大学植物病理研究室分离鉴定并提供）。其中，YP1为弱致病力菌株，YP6为强致病力菌株。病原菌分别于PSA培养基（马铃薯200 g，葡萄糖或蔗糖20 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL）上30℃培养72 h后，配制3×108CFU/mL菌液备用。选取生长时期一致的多年生稻叶片，于15∶00、温度为28℃～30℃时，采用剪叶法接种[7]，即剪去叶尖1～3 cm进行伤口接种。每个菌株接种4个植株，每个植株接种3～5个叶片（剑叶和上3叶）。接种21 d后调查白叶枯病发病情况。

1.4.3 抗性基因检测

1.4.3.1 DNA制备 取0.1 g PR23、PR24、PR25、PR101、PR107、长雄野生稻、RD23、F1（RD23/长雄野生稻）的幼嫩叶片，CTAB法[8]提取其基因组DNA，置于-20℃冰箱保存备用。

1.4.3.2 PCR鉴定 基于已报道和克隆的10个抗白叶枯病基因，包括7个显性抗病基因（Xa1、Xa3、Xa4、Xa10、Xa21、Xa23、Xa27）和3个隐性抗病基因（xa5、xa13、xa25）。利用已发表的功能标记或分子标记进行PCR扩增（表2），利用聚丙烯酰胺凝胶电泳[9]和1%～2%的琼脂糖凝胶电泳[10]对PCR产物进行检测。

2 结果与分析

2.1 田间病情调查

从表3可见，长雄野生稻、F1、PR101在早、晚稻全生育期对白叶枯病均表现出中抗以上抗性水平；RD23在早稻全生育期表现出中抗以上抗性水平，在晚稻的分蘖期和孕穗期表现出中感和感（表3）；5个多年生稻品种（系）均不同程度感白叶枯病，其中，PR107感病最严重，在早、晚稻苗期、分蘖期和孕穗期均表现出感病。

2.2 抗性水平评价

从供试菌种看，YP6菌株致病力最强，除了长雄野生稻外，能使多年生稻品种（系）以及RD23和F1均感病；YP1菌株致病力相对最弱，8个材料均对其表现出抗性（表4）。

表3 多年生稻白叶枯病田间病情调查结果

表4 多年生稻品种（系）及其亲本和F1田间病情调查和抗性水平评价结果

表5 白叶枯病抗性基因在多年生稻品种（系）中的分子检测结果

从多年生稻品种（系）看，长雄野生稻对9个供试菌种均表现出抗病；PR101对YP6菌株表现为中感，但对其他8个菌株均表现为中抗以上；PR23、PR24和PR25对9个菌株具有不同的抗性表现，对YP6、YP7、YP8、YP9菌株的感病程度与田间病情调查结果一致；PR107对除YP1外的8个菌株均表现出感病（表4）。

不同致病力生理小种的抗性水平鉴定结果虽然与田间调查结果存在一定差异，但感抗病情况基本吻合，说明该抗性水平评价结果可以直接指导田间白叶枯病害防治。

2.3 抗病基因检测

检测结果（表5）发现，长雄野生稻、RD23、F1、PR23、PR24、PR25、PR101和PR107具有Xa1、Xa4、Xa23和xa25等位基因，说明这些材料具有潜在的Xa1、Xa4、Xa23、xa25抗性基因。田间病情调查结果（表4）表明，RD23、PR23、PR24和PR25、PR107均感白叶枯病，而长雄野生稻、F1和PR101均抗白叶枯病，说明RD23、PR23、PR24、PR25、PR107携带的为感病等位基因，长雄野生稻、F1、PR101可能携带部分相关基因的抗病等位基因。

Xa3/Xa26基因的功能标记检测显示，在长雄野生稻、RD23、F1、PR23、PR25、PR101和PR107都未扩增出基因条带，推测长雄野生稻、RD23、F1、PR23、PR25、PR101和PR107中可能不携带Xa3/Xa26基因。Xa21基因的功能标记检测显示，只有长雄野生稻中扩增出抗病基因带型，而在RD23、F1、PR23、PR25、PR101和PR107扩增出感病基因带型，PR24中未扩增出条带，推测Xa21基因虽然是来源于长雄野生稻的白叶枯病抗性基因，但是没有遗传到其衍生的多年生稻品种（系）中。白叶枯病抗性基因xa25在RD23、PR23、PR24、PR25和PR107中为感病基因型（860 bp），且RD23、PR23、PR24、PR25和PR107均感白叶枯病，而在F1和PR101中为抗病基因型（约930 bp），推测xa25可能在F1和PR101的抗白叶枯病中起到了积极作用。Xa27基因功能标记检测表明，在长雄野生稻、F1和PR101中扩增出了抗病基因带型，PR107中未扩增出条带，在RD23、PR23、PR24、PR25扩增出感病基因带型，这与长雄野生稻、F1、PR101在田间病情调查结果相符，说明PR101可能携带Xa27抗病基因，起到主要抗病作用。

PR23、PR24、PR25和PR107携带已知的白叶枯病抗性基因Xa1、Xa4、Xa23、xa25的等位基因，但均感病，说明这几个抗病等位基因在这些材料中为感病基因型；虽然长雄野生稻携带已知白叶枯病抗性基因Xa1、Xa4、xa25、Xa21、Xa23、Xa27，但从其F1及衍生的5个多年生稻品种（系）的田间病情调查结果和携带基因看，Xa27和xa25基因可能是由长雄野生稻遗传给PR101并赋予其白叶枯病抗性的主要原因。

因此，PR101抗白叶枯病是由于其可能携带来自长雄野生稻的Xa27、xa25基因，而PR23、PR24、PR25和PR107这4个多年生稻品种（系）不具备本研究中用到的10个抗白叶枯病基因。

3 结论和讨论

白叶枯病在籼稻和粳稻中发病情况具有一定差异，一般籼稻重于粳稻，晚稻重于早稻[20]。根据对不同致病力白叶枯病菌生理小种抗性水平鉴定发现，PR101对大部分白叶枯病生理小种表现出抗性，并与田间生产条件下表现一致；PR23、PR24和PR25仅对部分白叶枯病生理小种具有抗性，需要进一步进行白叶枯病抗性遗传改良；PR107对大部分白叶枯病生理小种均感病，是制约其推广应用的主要限制因素，急需进行白叶枯病的抗性改良。

多年生稻PR23、PR24、PR25、PR101和PR107中均不含xa5、Xa3/Xa26、xa13、Xa10、Xa21抗病等位基因。PR23、PR24、PR25和PR107携带白叶枯病抗性等位基因Xa1、Xa4、Xa23、xa25，但根据田间病情调查发现这几个品系均感病，说明Xa1、Xa4、Xa23、xa25抗性等位基因在PR23、PR24、PR25、PR107中不起抗病作用；在长雄野生稻中检测到携带有Xa1、Xa4、Xa21、Xa23、xa25和Xa27等白叶枯病抗性等位基因，但从其F1及衍生的5个多年生稻品种（系）的田间病情调查结果和携带基因看，xa25、Xa27基因可能是通过长雄野生稻遗传到PR101的白叶枯病抗性等位基因。

xa25是一个隐性的抗白叶枯病主效基因，与其对应的显性基因是Xa25。xa25的供体品种是明恢63，对白叶枯菌生理小种PXO339表现为专化性抗性[21]。由于xa25的启动子突变，导致PthXo2无法被识别，则其表达便不受诱导，表现为抗性[22-23]。xa25的表达受显性等位基因Xa25的调控。王石平等[24]通过转基因技术将xa25的部分DNA片段导入到水稻品种中，抑制其表达从而增强水稻品种的抗性。所以猜想PR101可能是由于抑制了xa25的表达而表现为抗白叶枯病。

已有报道，白叶枯病抗性等位基因Xa27来自小粒野生稻（O.minuta）[7,25]，而来源于长雄野生稻的Xa27等位基因也可能是白叶枯病的抗性等位基因。WU等[26]发现，Xa27的表达是通过增加叶片维管束次生细胞壁厚度来抵御病原菌的侵染，推测PR101能抵抗白叶枯病可能是通过增加维管束次生细胞壁的厚度来抵御侵害。

多年生稻PR101对白叶枯病表现出良好抗性，可作为改良水稻抗白叶枯病的基因库。深入研究多年生稻PR101对白叶枯病的抗性反应，有助于水稻白叶枯病抗病育种研究，拓宽水稻抗白叶枯病育种的材料基础；而在利用PR23、PR24、PR25和PR107进行稻作生产时，需要注意及时有效的进行白叶枯病防治。