响应面法优化氨氮降解菌净化高原地区污水的研究

王 博,王 虹,欧阳晓芳,李 格

（青海大学化工学院， 青海 西宁 810016）

0 引言

随着我国现代化进程的加快和人民生活水平的日益提高，城市生活污水排放量不断增加，水体富营养化现象日益加剧。水体中的氨氮能引起水质恶化，造成多种危害[1]，并对污水的处理及回用造成严重影响，寻求经济高效的的氨氮去除方法对人类生产生活具有重要意义。氨氮去除方法主要包括物理法、化学法、生物法等，其中生物脱氮技术备受关注。生物脱氮利用从自然界中获得的有益微生物降低氨氮，具有处理成本低、容易操作、无二次污染、处理效果较好等优点[2]。

青海省地处青藏高原东北部，高原大陆性气候，冬季严寒而漫长，昼夜温差大，全省各地年平均气温在-4.1 ～ 10.3℃之间[3]，由于其高寒缺氧的地域特征，城市污水处理系统冬季运行较为困难。本试验从大通河南岸污染水源中筛选出氨氮降解菌，研究在污水体系中的最佳降解条件。本研究针对高原地区特殊的气候条件，发挥优势菌的处理效果，适应复杂的自然水体，对城市生活污水净化的起到优异的效果，其结果不仅为高原地区污水净化的进一步研究提供理论依据，还可结合驯化、诱变等生物技术，提高特殊环境中目标菌株的降解效率。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种筛选分离样品来源于西宁市大通河南岸污染水源，废水体系引用样品来源于西宁市第三污水处理厂；菌种活化培养基[4]，LB液体培养基、LB固体培养基[5]。

1.2 方法

1.2.1 氨氮降解菌的生长特性

接3-4环氨氮降解菌于50 mL LB液体培养基中，于25℃，160 r/min摇床下培养，每间隔12 h用紫外可见分光光度计测定菌液在600 nm下的OD值，记录OD值随时间的变化；同时采用血球计数板法记录菌数随时间的变化；在不同阶段，取一定量的菌液降解水样中氨氮，得到各阶段菌液对水中氨氮降解的能力。最后在同一图中绘制这3个量随时间的变化曲线，确定在该条件下氨氮降解菌降解能力最高所对应的培养时间。

1.2.2 降解条件的单因素试验

取水样50 mL于试管中，分别取接种量为1%，5%，10%，15%，20%，25%，30%的菌液， 降解时间为12，24，36，48，60，72，84 h 和调节 pH 值为 7，8，9，10，11，12，13，在25℃，160 r/min条件下进行单因素试验，采用纳氏试剂法[6]测出各锥形瓶以及加入等量菌液的空白试验的氨氮浓度，确定氨氮降解菌在水样中氨氮降解的最佳条件。

1.2.3 响应面优化试验

在确定单因素降解条件的基础上，选择接种量、降解时间、pH值3个因素，利用Box-Behnken设计3因素3水平的响应面试验，见表1。

表1 实验的因素水平及编码

1.3 验证试验

在响应面试验确定的最佳降解条件基础上做3个平行试验，结果取平均值，并与响应面预测值进行比较以验证模型可靠性，从而得出最终优化结果。

2 结果与分析

2.1 氨氮降解菌的生长特性分析

以时间为横坐标，600 nm下的OD值、生物量、氨氮降解率为纵坐标绘制的氨氮降解菌的生长特性曲线见图1。

图1 氨氮降解菌生长特性

由图1可见，在LB液体培养基中，OD值到84 h仍未出现明显下降，接种60～72 h，生物量趋于平稳。比较生长曲线与氨氮降解率曲线法线，菌株降解氨氮最快的时间在稳定期的60～72 h，培养至72 h之后降解率有所降低。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 接种量对氨氮降解菌降解效率的影响

在pH值为7的50 mL生活污水中，分别取体积比 1%，5%，10%，15%，20%，25%，30%的菌液，设3组平行，25℃，160 r/min摇床降解60 h，测定氨氮降解率。结果表明，接种量在低于10%时，随菌量增加，氨氮降解率随之升高；在接种量为10%时，水样中氨氮降解率达到高，为73.38%，见图2。

2.2.2 降解时间对氨氮降解菌降解效率的影响

在pH值为7的50 mL生活污水中，接入10%的菌液，设置3组平行试验，25℃，160 r/min摇床分别降解 12，24，36，48，60，72，84 h。在时间到达后，测定氨氮降解率。结果表明，菌株对氨氮的降解率随着时间的延长明显提高，在60 h达到最佳的氨氮降解率，为 79.46%，见图2。

2.2.3 pH值对氨氮降解菌降解效率的影响

在50 mL生活污水中，接入10%的菌液，分别调节 pH 值为 5，6，7，8，9，10，11，设置 3 组平行试验（水样初始pH值接近7），25℃，160 r/min摇床降解60 h，测定氨氮降解率。结果表明，菌株在pH值为8时对氨氮的降解率达到最高，为82.24%，见图2。

图2 接种量，pH值，降解时间对菌株氨氮去除的影响

2.3 响应面优化试验结果

2.3.1 结果的统计分析和回归数学模型的建立

利用 Box-Behnken Design（BBD）设计 3因素 3水平共17个试验点的试验方案，运用Design Expert 8.0对BBD响应面试验结果进行分析[7]，见表2。

表2 Box-Behnken响应面设计回归分析

运用Design-Expert软件，按表2中的试验数据拟合得到三元二次回归方程：

响应值降解率 =-3.57899+0.032107A+0.068459B+0.561 13C+1.666 67 × 10-6AB+1.500 00 × 10-5AC-5.81250 × 10-4BC-1.42620 × 10-3A2-5.0875 × 10-4B2-0.034 180C2

单因素效应分析：令回归方程中的3个未知数中的2个固定于0水平，对数学模型进行分析得到以其中1个因素为决策变量的偏回归模型[8]：

响应值降解率A=-3.578 99+0.032 107A-1.426 20 × 10-3A2

响应值降解率B=-3.578 99+0.068 459B-5.087 15 × 10-4B2

响应值降解率C=-3.578 99+0.561 13C-0.034 180C2

上述3个方程的二次项系数均为负值，说明其表征的抛物线都开口向下，因此，3个因素取值均存在最佳值，过大或过小均会使响应值降低。

对方程模型进行方差分析，结果见表3、表4。

表3 方差分析表

根据概率P值越小影响越显著的原理 (P＜0.1为高度显著，P＜ 0.05 为显著，P＞ 0.05 为不显著），由表3方差分析，可知模型极其显著，可信度较高；在模型中，单因素 A，B，C 和二次项A2，B2，C2（P＜ 0.05）均对模型影响显著。 模型失拟率为 0.410 0（＞ 0.05），表明失拟不显著，故可以用此模型对不同条件下的氨氮降解率进行分析和预测。

表4 回归模型方差分析

由表4可以得出，模型的相关系数R2=0.989 7说明模型可以解释98.97%的试验所得降解率。校正系数RAdj2=97.65%与相关系数接近，只有2.35%的降解率总变异不能用此模型解释。变异系数CV=1.05%＜10%，说明模型能很好地反映真实的试验值，即试验的可靠性较高。

2.3.2 因素间交互作用的分析

为了进一步研究相关变量之间的交互作用和确定最优点，通过软件做接种量、pH值、降解时间3个主要影响因素对氨氮降解水平交互影响的等高线及响应面立体分析图，见图3。由等高线图可以直观地反映出2变量交互作用的显著程度，圆形表示2因素交互作用不显著，椭圆形表示2因素交互作用显著[9]。由图3可以看出AC，BC交叉项的交互作用对响应值氨氮降解率的影响显著。

图3 接种量与pH值，接种量和降解时间，pH值和降解时间影响氨氮降解效率的等高线图及响应面

2.3.3 响应面分析最佳应用条件的确定

从响应面分析得到降解条件最优组合及氨氮降解率的预测最大值见表5。

表5 最优组合与最大值

2.4 验证试验结果

按照上面的试验结果，采用生活污水体系，以氨氮降解菌接种量为 11.33%、降解时间为 62.92 h，pH值为7.68的应用条件进行验证试验，结果为：91.21% ，89.96% ，90.29% ，89.99% ， 其 平 均 值 为90.36%与最大响应值的预测值基本一致，表明该模型能很好地预测实际降解情况。

3 结论与展望

本试验对大通河南岸污染水源筛选分离出氨氮去除率较高优势菌株进行生长特性曲线研究，确定菌液氨氮降解能力最高所对应的培养时间为60～72 h；通过单因素试验，确定菌株在接种量10%，降解时间为60 h，pH 值为8时降解率最高，为82.24%；利用Box-Behnken设计原理，设计3因素3水平的响应面试验，分析接种量、pH值、降解时间3个因素对降解条件的影响，得到最佳净化的应用条件组合：接种量 11.33%、降解时间为 62.92 h，pH 值为 7.68，菌株对废水中氨氮的降解率预测最大值为91.03%，由响应面方差分析可知，降解模型显著，接种量、降解时间、pH值对降解率影响显著，且3因素交互作用对响应值有一定影响。按照最佳应用条件进行验证试验，得到验证实验结果平均值为90.36%，与最大响应值的预测值基本一致，且比单因素研究条件下提高了8.12%，试验表明响应面法对氨氮降解菌在高原环境中降解污水条件的优化合理可行，研究结果为高原环境微生物净化生活污水应用提供理论依据。在后续的研究中可运用研究所得模型与实际污水处理系统相结合，最大程度去除污水中氨氮，实现污水的生态良性演化。