大肠埃希氏菌-胸膜肺炎放线杆菌穿梭载体构建

李建，张磊，张媛，彭国瑞，王秀丽，刘博，辛凌翔，罗玉峰，蒋玉文

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

大肠埃希氏菌-胸膜肺炎放线杆菌穿梭载体构建

李建，张磊，张媛，彭国瑞，王秀丽，刘博，辛凌翔，罗玉峰，蒋玉文*

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

合成胸膜肺炎放线杆菌质粒pKMA2425上长度为126 bp及2214 bp的2个DNA片段，克隆到大肠埃希氏菌质粒pGSI中，获得重组质粒pGSIA。PCR扩增pTKRED上的大观霉素抗性基因及线性化的pGSIA(126 bp DNA片段-pGSI-2214 bp DNA片段)，连接，电转化胸膜肺炎放线杆菌，在大观霉素的选择压力下筛选鉴定到连接正确的质粒，命名为pGSIAS。pGSIAS测序结果符合预期。在大观霉素的选择压力下，含有pGSIAS的胸膜肺炎放线杆菌血清1～10型菌株均生长良好；在氨苄青霉素的选择压力下，含有pGSIAS的大肠埃希氏菌生长良好。结果表明本研究构建的大肠埃希氏菌-胸膜肺炎放线杆菌穿梭载体pGSIAS序列正确，在胸膜肺炎放线杆菌及大肠埃希氏菌中均能复制并表达质粒上的相关基因。

大肠埃希氏菌；胸膜肺炎放线杆菌；穿梭载体

猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia, PCP)，又称坏死性胸膜肺炎，是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae, APP)[1]引起的一种猪高度传染性呼吸道疾病。该病于1957年由Pattison等[2]首次报道，此后逐渐扩散，目前已遍布世界各地，在美洲(美国、加拿大、墨西哥)、欧洲(瑞士、瑞典、丹麦)、澳大利亚、亚洲(日本、韩国和中国[3])等地均有流行，但各地方所流行的血清型不尽相同。1～4月龄的猪感染时死亡率为5%～30%，在新引进猪群中多呈急性爆发，发病率和死亡率在20%以上，最急性的死亡率可高达80%～100%[4]。由于各个猪场的免疫情况不同，死亡率也不尽相同[5]。1989年国外报道APP导致猪平均日增重下降33.6%,饲料报酬下降25.5%[6]。研究证实，预防和控制本病最有效的措施仍然是疫苗免疫接种。从临床上观察到，无论是自然感染还是通过人工方法感染APP后存活的猪，均获得了对所有血清型菌株再次感染的免疫保护力，暗示若干保护性抗原或免疫复合物可能在交叉保护中起着关键性的作用，这些成分可能仅在病原感染动物时被诱导产生，而在动物体外用培养基培养时并不产生。因此，弱毒活疫苗有可能解决传统灭活疫苗、亚单位疫苗及菌影疫苗等交叉保护力不理想的问题。

利用DNA定点同源重组技术可快速对特定DNA片段进行缺失、置换或插入，用以构建减毒株。大肠埃希氏菌-胸膜肺炎放线杆菌穿梭载体是该平台技术的重要元件，如携带重组酶表达元件，则可极大提高同源重组效率；同时，也可携带其他基因表达元件或基因沉默元件，通过基因的过量表达、表达量减少或完全抑制表达来实现对该基因功能的研究。本研究以大肠埃希氏菌质粒pGSI、胸膜肺炎放线杆菌pKMA2425及大观霉素抗性基因为元件，构建大肠埃希氏菌-胸膜肺炎放线杆菌穿梭载体。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒 pTKRED购自NTCC典型培养物保藏中心。

1.1.2 培养基 普通琼脂、普通肉汤、TSA、TSB均购自北京中海生物科技有限公司；氨苄青霉素购自Amresco公司；大观霉素购自上海江莱生物科技有限公司。

1.1.3 主要试剂 质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；PCR产物回收试剂盒购自北京绿源伯德生物科技有限公司；USERTM酶购自NEB公司；PrimeSTAR®GXL DNA Polymerase购自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 合成DNA片段 合成胸膜肺炎放线杆菌质粒pKMA2425(Genbank：AJ830714.1)20～145 bp片段(全长126 bp)及962～19 bp(全长2214 bp)，克隆到大肠埃希氏菌质粒pGSI中，命名为pGSIA。

1.2.2 引物设计与合成 利用软件Oligo6.7.1.0进行引物的设计，各DNA片段所需引物见表1。

1.2.3 提取质粒 在含100 μg/mL氨苄青霉素的普通肉汤中培养含pGSIA的大肠埃希氏菌，提取pGSIA，溶于超纯水。在含100 μg/mL大观霉素的普通肉汤中培养含pTKRED的大肠埃希氏菌，提取pTKRED，溶于超纯水。

1.2.4 PCR扩增构建穿梭载体所需元件 以环状pGSIA为模板扩增线性pGSIA，以pTKRED为模板扩增大观霉素抗性基因。胶回收，溶于TE，测定DNA浓度。

1.2.5 载体连接 线性pGSIA 0.01 pmol，大观霉素抗性基因0.1 pmol，USERTM enzyme mix 1 μL，TE补足10 μL。37 ℃反应20 min，25 ℃反应20 min，用PCR产物回收试剂盒回收连接产物。

表1 引物Tab 1 Primers

1.2.6 电转化 用胸膜肺炎放线杆菌血清4型菌株制备电转化感受态细胞，将回收的连接产物电转化到感受态细胞中，电转化参数为电压2.5 kV，电容25 μF，脉冲电阻800 Ω。非抗性复苏3 h，涂布含100 μg/mL大观霉素的平板。

1.2.7 载体的测序鉴定 取单菌落培养后提取质粒，送交中美泰和生物技术(北京)有限公司测序。

1.2.8 穿梭质粒复制表达能力验证 鉴定正确的质粒命名为pGSIAS(图1)，取pGSIAS转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞，非抗性复苏3 h后，涂布含100 μg/mL氨苄青霉素的平板。取单菌落培养后，提取质粒，电转化胸膜肺炎放线杆菌血清1～3及5～10型菌株，非抗性复苏3 h后，涂布含100 μg/mL大观霉素的平板。取含pGSIAS的大肠埃希氏菌单菌落接种含100 μg/mL氨苄青霉素的普通肉汤，取含pGSIAS的胸膜肺炎放线杆菌接种含100 μg/mL大观霉素、0.001% NAD及8%胎牛血清的TSB，37 ℃ 200 r/min培养24 h，观察细菌是否生长。

1.2.9 含穿梭质粒菌株的鉴定 PCR扩增含pGSIAS的大肠埃希氏菌及胸膜肺炎放线杆菌血清1～10型菌株的16SrDNA片段，送交中美泰和生物技术(北京)有限公司测序。对胸膜肺炎放线杆菌血清1～10型菌株进行血清型鉴定。

2 结果与分析

2.1 pGSIA序列分析 用DNAMAN7.0.2.176对pGSIA测序结果与预期序列进行比对，结果同源性为100%，符合预期。

2.2 载体元件PCR扩增结果 以环状pGSIA为模板扩增出了全长为5212 bp的线性pGSIA(图2)，以pTKRED为模板扩增出了全长为1026 bp的大观霉素抗性基因(图3)。上述两个DNA片段用于拼接穿梭载体。

M:DL10000 DNA Marker1: 线性pGSIA PCR产物1: linear pGSIA PCR product图2 线性pGSIA PCR产物电泳图Fig 2 Electrophoresis photo of linear pGSIA PCR product

M: DNA Marker II1: 大观霉素抗性基因PCR产物1: Spectinomycin resistance gene PCR product图3 大观霉素抗性基因PCR产物电泳图Fig 3 Electrophoresis photo of spectinomycin resistance gene PCR product

2.3 pGSIAS序列分析 用DNAMAN7.0.2.176对pGSIAS测序结果与预期序列进行比对，结果同源性为100%，符合预期。

2.4 穿梭质粒pGSIAS功能验证 含有pGSIAS的大肠埃希氏菌DH5α株在100 μg/mL氨苄青霉素的选择压力下生长良好；含有pGSIAS的胸膜肺炎放线杆菌血清1～10型菌株在100 μg/mL大观霉素的选择压力下生长良好；结果表明pGSIAS在大肠埃希氏菌及胸膜肺炎放线杆菌中均能正常复制，在大肠埃希氏菌中可表达氨苄青霉素抗性基因，在胸膜肺炎放线杆菌中可表达大观霉素抗性基因，证明pGSIAS是大肠埃希氏菌-胸膜肺炎放线杆菌穿梭质粒载体。

2.5 含有穿梭质粒pGSIAS的菌株的鉴定 大肠埃希氏菌DH5α株及胸膜肺炎放线杆菌血清1～10型菌株均扩增出了全长为1505 bp的16SrDNA片段(图4)，测序结果与Genbank上的序列进行比对，结果表明上述11株菌株均不是杂菌。胸膜肺炎放线杆菌间接血凝试验结果表明10株胸膜肺炎放线杆菌的血清型均与对应标识一致。

M:DL2000 DNA Marker; 1～11: 16SrDNA片段PCR产物1～11:16SrDNA fragment PCR product图4 16SrDNA片段PCR产物电泳图Fig 4 Electrophoresis photo of 16SrDNA fragment PCR product

3 讨论与小结

穿梭质粒具有两套来源于不同生物的复制子及选择标记元件，可以克服亲缘关系较远的两种生物在遗传上的障碍，实现同一质粒同时在不同生物体内的复制[8]。由于大肠埃希氏菌操作简便成熟，其质粒拷贝数高，重组质粒易于大量制备，研究者偏爱构建在大肠埃希氏菌中的穿梭载体。

Guy Lalonde等[9]构建了第1个大肠埃希氏菌-胸膜肺炎放线杆菌放线杆菌穿梭载体pYG53。J. Frey[10]构建了7800 bp的大肠埃希氏菌-胸膜肺炎放线杆菌放线杆菌穿梭载体pJFF224-NX及pJFF224-XN。本研究构建的大肠埃希氏菌-胸膜肺炎放线杆菌放线杆菌穿梭载体pGSIAS全长6220 bp，容纳外源DNA片段的能力比pJFF224-NX及pJFF224-XN更大。

pGSIAS在10种血清型胸膜肺炎放线杆菌中均能正常复制，稳定遗传，有效表达大观霉素抗性基因，表明该载体具有大肠埃希氏菌-胸膜肺炎放线杆菌放线杆菌穿梭质粒载体的相关功能。本试验操作中，在转化步骤可能由质粒溶液带入杂菌，影响实验结果的可靠性，因此，本试验在转化的后续操作中挑取单菌落开展试验，并且对相关菌株进行了定种鉴定，16SrDNA片段序列比对结果确定了试验过程中未污染杂菌，胸膜肺炎放线杆菌间接血凝定型试验结果确定了未发生血清型间交叉污染。上述结果表明穿梭质粒pGSIAS功能验证结果可靠。

本研究构建了大肠埃希氏菌-胸膜肺炎放线杆菌穿梭载体pGSIAS，并对其穿梭功能进行了验证，可以此为基础，进一步开展疫苗开发及基因功能研究等方面的工作。

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(编辑：侯向辉)

Construction ofEscherichiacoli-ActinobacilluspleuropneumoniaeShuttle Vector

LI Jian, ZHANG Lei, ZHANG Yuan, PENG Guo-rui, WANG Xiu-li, LIU Bo, XIN Ling-xiang, LUO Yu-feng, JIANG Yu-wen*

(China Institute of Veterinary Drug Control,Beijing 100081,China)

Jiang Yu-wen,E-mail:jiangyuwen@ivdc.org.cn

A 126bp-length DNA fragment and a 2214bp-length DNA fragment fromActinobacilluspleuropneumoniaeplasmid pKMA2425 were synthesized and then cloned into pGSI. The constructed recombinant plasmid was named pGSIA. Spectinomycin resistance gene amplified by PCR from pTKRED and linear pGSIA(126bp-length DNA fragment+pGSI+2214 bp-length DNA fragment) amplified by PCR from circular pGSIA were ligated together and then transformed intoActinobacilluspleuropneumoniaeby electroporation. In the selection pressure of spectinomycin, correctly ligated recombinant plasmid was gained by PCR identification and named pGSIAS. Sequencing result of pGSIAS was as expected. In the selection pressure of spectinomycin,Actinobacilluspleuropneumoniaeserotypes 1～10 containing pGSIAS growed well. In the selection pressure of ampicillin,Escherichiacolicontaining pGSIAS growed well. The results showed that the sequence ofEscherichiacoli-Actinobacilluspleuropneumoniaeshuttle vector pGSIAS was correct. In addition, pGSIAS could replicate itself and express related genes on the vector inActinobacilluspleuropneumoniaeorEscherichiacoli.

Escherichiacoli;Actinobacilluspleuropneumoniae;shuttle Vector

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.8.01

国家重点研发计划资助项目(2016YFC1202303)

李建，硕士，从事兽用生物制品研究。

蒋玉文。E-mail:jiangyuwen@ivdc.org.cn

2017-01-18

A

1002-1280 (2017) 08-0001-05

S852.61