致泻性大肠埃希氏菌检验操作要点及质量控制探究

《食品安全国家标准 预包装食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）于2021年11月22日实施，该标准修改了肉制品和即食果蔬制品的致病菌指标，删除了大肠埃希氏菌O157:H7/NM项目，新增加了致泻大肠埃希氏菌项目[1]，引起了检验工作者的广泛关注，也对该项目的检测提出了更高的要求。本文通过对食品中致泻大肠埃希氏菌检验原理进行解读，对检验操作要点进行总结归纳，对质量控制要求进行探讨，为致泻大肠埃希氏菌的检验工作提供参考。

1 致泻大肠埃希氏菌概述

1.1 简介

致泻大肠埃希氏菌是一类能引起人体以腹泻症状为主的大肠埃希氏菌。致泻大肠埃希氏菌分为5种，包括肠道致病性大肠埃希氏菌、肠道侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、产志贺毒素大肠埃希氏菌和肠道集聚性大肠埃希氏菌。

1.2 污染源

致泻大肠埃希氏菌常见的污染食品为生禽畜肉、熟肉制品、水产品、蔬菜以及水果等[2]。致泻大肠埃希氏菌可通过污染水源或土壤，进而污染食品。

1.3 致泻大肠埃希氏菌与大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希菌的区别

大肠菌群，是指在36 ℃培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰阴性无芽孢杆菌，包括埃希菌属、肠杆菌属、柠檬酸菌属和克雷伯菌属等；粪大肠菌群，又称耐热大肠菌群，是一群在44.5 ℃条件下培养24～48 h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰阴性无芽孢杆菌，主要由大肠埃希菌组成，还包括与粪便污染无直接相关性的其他菌株，如肺炎克雷伯菌；大肠埃希菌隶属肠杆菌科埃希菌属，其广泛存在于人和温血动物的肠道中，是革兰阴性无芽孢杆菌，能够在44.5 ℃发酵乳糖产酸产气，IMVC生化试验结果为“++--”或“-+--”；致泻大肠埃希氏菌是一类能引起人体以腹泻症状为主的大肠埃希菌。

2 检验操作要点

2.1 检验标准及限量要求

食品中致泻大肠埃希氏菌的检验执行《食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》（GB 4789.6—2016）[3]。《食品安全国家标准 预包装食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）标准中，对肉制品和即食果蔬制品的致泻大肠埃希氏菌进行了限量规定。《鲜、冻四分体牛肉》（GB/T 9960—2008）、《鲜冻胴体羊肉》（GB/T 9961—2008）等标准中也规定了需对致泻大肠埃希氏菌进行检验。

2.2 检验步骤及流程解读

致泻大肠埃希氏菌的检验流程可概括为样品处理→营养肉汤进行预增菌培养→肠道菌增菌肉汤中进行增菌培养→麦康凯琼脂（MAC）和伊红美蓝琼脂（EMB）进行分离→对典型或可疑菌落进行生化鉴定→取生化反应符合特征的菌落进行PCR确认试验和血清学试验（选做）→报告每25 g样品中是否检出致泻大肠埃希氏菌，并报告样品中检出的某类致泻大肠埃希氏菌的血清型别。

2.3 操作注意事项

①样品为带骨肉制品时，取可食用部位（肌肉或组织）。对易产生较大颗粒的样品（如肉类）进行检测时，建议使用带滤网均质袋，以便均质后用吸管吸取匀液。②取前增菌液接种肠道菌增菌肉汤后，需在（42±1）℃温度下进行培养，该温度范围内培养有助于抑制非肠道菌生长。③分离划线用直径3 mm的接种环（1环约10 µL）；可疑菌落的选取应是每个琼脂平板上分别取10～20个（10个以下的全选）乳糖发酵和不发酵的菌落；生化试验和PCR确认试验均应挑取单个可疑菌落的纯培养物。为保证结果的准确性，必要时可进行二次纯化。④在培养箱中，为了防止中间培养皿过热，平板的叠放高度不宜超过6个培养皿。⑤在三糖铁试验时，要保证三糖铁琼脂斜面部分和管下部琼脂的长度，一般要求琼脂底部和斜面最低点的距离应不少于4 cm，穿刺时宜穿刺至培养基底部3～5 mm处；在三糖铁琼脂培养时，应将试管口松开，保持管内有充足的氧气，否则由于氧气不足，斜面酸性产物不能氧化恢复红色，而影响结果的判断。⑥在氰化钾试验时，由于氰化钾是剧毒药品，应注意小心操作，切勿沾染。⑦增菌后的所有操作均应在生物安全二级实验室进行，操作时应有防污染的措施；在进行可能产生气溶胶的操作时，均应在生物安全柜内完成。⑧在血清学试验时，首先要进行菌体的自凝性检查。大肠埃希氏菌H抗原在传代中容易丢失或发育不良，需在半固体上传代3次，观察生长情况。如不扩散，则表示H抗原丢失，无法做H抗原凝集试验。⑨按照标准要求，需要先对可疑菌落进行生化鉴定，生化鉴定为大肠埃希氏菌后，再进行毒力基因的检测，判定致泻大肠埃希氏菌的种类。因为在肠杆菌科中，一些致病菌也存在相同的毒力基因，所以不能对可疑菌落直接进行毒力基因检测来判定致泻大肠埃希氏菌的种类。⑩一般情况下，根据特征毒力基因检测结果可确认样品中致泻大肠埃希菌的型别，不需要进行血清学试验。在食源性疾病暴发溯源调查时，血清学分型简便易行。在确定了致泻大肠埃希菌型别后，可以快速对不同来源菌株的同源性进行初步判断，利于溯源调查。

3 质量控制要求

在食品微生物检验过程中，为保证检验结果的可靠性，必须使用经验证的检测方法，严格按照食品微生物实验室质量管理要求进行检验[4]。

3.1 人员要求

①微生物实验人员应掌握微生物检验方面的基础操作，如培养基制备、消毒灭菌、无菌操作、倒平板和菌种传代等。经考核合格后持证上岗，并制定继续教育计划，不断更新知识和技能。②检验人员必须熟悉检验标准、检验程序、方法和结果评价。③检验人员应经过实验室生物安全方面的培训，熟悉生物安全操作知识和消毒灭菌知识，保证自身安全，防止污染扩散。

3.2 环境控制要求

①PCR确认试验的试验环境和试验操作应符合食品分子生物学检测的要求，注意预防污染。使用和处理有毒有害物质时，注意实验人员的安全防护和对环境的保护。②为了控制环境污染，每次检验过程中，于检验台上打开两块平板计数琼脂平板，并在检验环境中暴露不少于15 min，将此平板与本批次样品同时进行培养，以掌握检验过程中是否存在来自检验环境的污染。③定期对生物安全实验室和生物安全柜进行洁净度监测，监测项目包括悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、温湿度和照度等。

3.3 设备、设施要求

①检验中所用设备必须是经过检定的设备。检验所用耗材，如吸管、培养基、平皿必须完全灭菌。重复使用的耗材应彻底清洗干净，不得残留抑菌物质。②非简单压力容器操作人员需持特种作业人员上岗证。高压蒸汽灭菌器，应用化学指示胶带、指示卡或生物指示剂，验证灭菌效果。③监测恒温培养箱温度是否恒定，温度变化不可超过±1 ℃。建议安装温度监控系统，对恒温培养箱的温度进行实时监控。④对于一些容易污染微生物的仪器设备，如培养箱、水浴锅、冰箱、生物安全柜和层流超净工作台等，定期进行清洁、消毒。

3.4 培养基、试剂要求

①实验过程中使用的培养基和试剂按照GB 4789.28—2013的规定进行验收和性能测试，做好记录。不应使用结块、颜色发生变化或其他物理性状发生改变的脱水培养基。②培养基溶解和灭菌后分别测定pH值，以保证细菌培养所需pH值符合要求。配制好的培养基应标明配制日期，不宜放置过久。采用经验证的灭菌程序灭菌；已灭菌的培养基可在4～10 ℃存放7 d，存放时应避免阳光直射、液体蒸发和杂菌侵入；当液体颜色变化、体积变化时，应废弃、不用。③检测试剂盒和诊断血清验收时注意查看批号、有效期、血清效价、透明度与色泽，及时冷藏（2～8 ℃）储存。使用过程中，尽量缩短脱离冷藏环境的时间。

3.5 内外部质量控制

①实验过程中要做空白对照，如果空白对照板上出现菌落时，应废弃本次实验结果，并从实验环境、培养基、平皿和吸管等方面分析污染来源。②每次进行PCR检测时应使用肠道致病性大肠埃希氏菌、肠道侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、产志贺毒素大肠埃希氏菌/肠出血性大肠杆菌、肠道集聚性大肠埃希氏菌标准菌株作为阳性对照。同时使用大肠埃希氏菌ATCC 25922或等效标准菌株作为阴性对照，以灭菌去离子水为空白对照，控制PCR污染体系。肠道致病性大肠埃希氏菌、肠道侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、产志贺毒素大肠埃希氏菌/肠出血性大肠杆菌、肠道集聚性大肠埃希氏菌标准菌株应从专业微生物保藏机构、同行认可的专业权威机构或有资质的商业派生菌株生产厂家等认可的途径获得，菌株经过验证后使用。CICC 10667、CICC 24186、CICC 24188和CICC 24189分别属于产肠毒素大肠埃希氏菌、肠道集聚性大肠埃希氏菌、肠道侵袭性大肠埃希氏菌和肠道致病性大肠埃希氏菌。CICC 10670和CICC 24187属于肠道出血性大肠埃希氏菌[5]。③定期使用致泻大肠埃希氏菌标准菌株或相应定量活菌参考品，在阳性对照实验室内，用适当的食品样品进行阳性试验验证，染菌量应控制在每25 g样品中含10～100 CFU活菌，并进行记录，质控频次至少每两个月进行1次。④通过参加该项目实验室间比对或能力验证，进行质量评估，及时发现自身存在的问题和与其他实验室间的差距。

4 结语

食品微生物检验受诸多因素的影响，如样品中微生物分布的不均匀性、环境带来的污染、培养基和试剂的质量不符合要求和人员操作带来的偏差等。生产企业和检验机构的检测人员在进行致泻大肠埃希氏菌检验时，应严格按照标准规定的检验程序操作，掌握操作要点和注意事项，从人、机、料、法和环等方面进行质量控制，确保检测结果准确、可靠。