可乐定ELISA检测试剂盒的研制及其性能评价

李丹妮 ，顾欣，黄华，陆沛嗣，王学生，黄士新*

(1.上海市兽药饲料检测所，上海 201103；2.上海容晖生物科技有限公司，上海 200231)

可乐定ELISA检测试剂盒的研制及其性能评价

李丹妮1，顾欣1，黄华2，陆沛嗣2，王学生2，黄士新1*

(1.上海市兽药饲料检测所，上海 201103；2.上海容晖生物科技有限公司，上海 200231)

通过制备可乐定完全抗原，免疫新西兰大白兔，得到特异性多克隆抗体，和HRP标记的羊抗兔构建间接ELISA检测法试剂盒，并进行性能测试评价。结果表明，吸光度百分比值与可乐定质量浓度的对数在0.1～8.1 μg/L呈线性关系，相关系数R2为0.977，半数抑制浓度(IC50)为0.675 ng/mL，检测限为0.2 ng/mL，在浓度为0.15～0.5 ng/mL添加范围内，回收率为81%～109%，具备良好的特异性，可用于动物尿样、血清和组织中的可乐定残留检测。

可乐定；酶联免疫吸附测定；多克隆抗体；试剂盒

可乐定(Clonidine)化学名[2-(2,6-二氯苯基)亚氨基]咪唑啉，是一种通过刺激脑干α2-肾上腺受体动剂，能抑制中枢神经降低血压药物。同时可乐定是咪唑啉衍生物具有激发与促进垂体增加分泌生长激素(GH)的作用，故可乐定还可提高动物生长和改善胴体品质[1-3]，畜禽类饲养含有可乐定的饲料可以增加畜禽类体重和瘦肉率，但可乐定毒副作用大、易积累，食用含有可乐定残留的动物源性食品，对人体健康具有相当的危害。农业部2010年发布了1519号公告，向社会公布了禁止在饲料、动物饮用水和畜禽水产养殖过程中使用的药物和物质清单，可乐定已明确被列入其中[4]。

近年来由于国家对瘦肉精类药物的监管力度不断加大，加强对饲料、经济动物尿样的可乐定残留检测是保障食品安全重要手段，目前检测动物组织、血液中可乐定残留的方法，主要是液相色谱-串联质谱法(LC/MS/MS)[5-7]，该方法灵敏度较高，但检测时间长、操作较繁琐、检测成高，不适用于养殖业和现场快速筛查。本研究通过制备可乐定完全抗原，免疫新西兰大白兔产生特异性抗体，根据免疫竞争原理，采用抗原抗体特异性反应，建立了一种适用于动物尿液、组织中可乐定残留检测的酶联免疫检测试剂盒，具有操作简单、灵敏度高、特异性好、检测时间短等优点，适合基层和现场快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂 可乐定标准品(纯度≥99%)，碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)(纯度≥99%)，牛血清白蛋白(BSA)，卵白蛋白(OVA)，弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)等均购自美国Sigma公司；辣根过氧化物酶(HRP)购自上海雪满生物公司；N ,N -二甲基甲酰胺(GR)等其他化学试剂购自国药集团。

1.1.2 仪器与设备 酶标仪360T，上海科华公司；旋转蒸发仪R-215，BuchiLabortechnik AC；高速冷冻离心机CT14RDII，上海天美；紫外分光光度仪UV-7502PC，上海欣茂仪器有限公司；WatersXevo TM TQ MS，超高效液相色谱—串联质谱仪，配有电喷雾(ESI+)离子源(美国Waters公司)；MassLynx v4.1质谱工作站(美国Waters公司)。

1.2 方法

1.2.1 可乐定完全抗原的制备[8-9]在可乐定的苯环4位上引入胺基为商品化的阿可乐定(Apraclonidine)，阿可乐定和丁二酸酐酰化反应形成CLD-COOH即接臂的可乐定半抗原，其合成过程见图1，再经过缩合剂EDC·HCl和载体蛋偶联成完全抗原。560 mg盐酸阿可乐定(Apraclonidine hydrochloride)、200 mg丁二酸酐置于1 mL吡啶和3 mL苯于反瓶，加热搅拌回流5 h，待反应完全后，减压蒸去溶剂，固体加无水乙醇和活性炭一起搅拌，加热回流，滤除活性炭，滤液加入氯化氢乙醇溶液冷却形成结晶，过滤，用冷无水乙醇洗结晶，干燥得到可乐定的半抗原CLD-COOH。将10 mg CLD-COOH半抗原、8 mg NHS和10 mg EDC溶于0.5 mL DMF中(混合物A)，4 ℃搅拌过夜。次日，先将30 mg BSA(OVA)溶于3 mL 0.02 mol/L的磷酸氢二钠溶液中，并将混合物A逐滴加入，室温搅拌6 h。装入透析袋，用0.01 mol/L pH7.2的PBS透析，并换液4次，得到可乐定的完全抗原CLD-BSA或CLD-OVA。

图1 半抗原可乐定接臂合成路线Fig 1 Synthesis scheme of clonidine hapten

1.2.2 可乐定多克隆抗体的制备[10-11]体重大约2 kg的新西兰雄性大白兔，采取背部皮下多点注射的方式进行免疫。基础免疫时，取200 μg(0.4 mg/mL)的可乐定的完全抗原CLD-OVA溶液与等量的CFA(弗氏完全佐剂)混匀乳化，直至形成乳白色的油包水型乳浊液，然后进行注射。2周后进行加强免疫，免疫剂量为100 μg与等量的IFA(不完全佐剂)，以后每7 d加强免疫，次数为3～4次具体视情况定，取耳缘静脉血，测血清效价，直到效价不再升高，采用颈动脉取血，离心得到血清。采用CLD-BSA免疫吸附凝胶进行亲和层析纯化，将得到的多克隆抗体加入一定比例的甘油，置-20 ℃保存。

1.2.3 可乐定完全抗原的包被[11-12]用50 mmol/L pH9.6碳酸盐缓冲液将可乐定抗原(CLD-BSA)稀释成系列浓度(0.5～8 μg/μL)，依次包被到96孔酶标板，每孔包被量100 μL。4 ℃孵育过夜，将孔中液体倾去，每孔加入250 μL 0.5% BSA 0.01 mol/L PBS pH7.4封闭，于37 ℃恒温箱中孵育2 h，将孔中封闭液倾去，放入温度37 ℃、相对湿度20%的烘房烘干，铝箔包装放存4 ℃待用。

1.2.4 样品检测 动物尿液直接用于检测，如尿液浑浊，将尿液于5000 r/min离心5 min取上清液用于检测。在每孔中加入50 μL系列浓度的可乐定标准品溶液(或样品溶液)和50 μL稀释后的可乐定抗体，25 ℃反应30 min；洗涤4～5次后加入100 μL稀释后的酶标二抗，25 ℃反应30 min；洗涤4～5次后加入50 μL底物液A和50 μL底物液B，25 ℃显色反应15 min；最后加入50 μL终止液终止反应，设定酶标仪于波长450 nm处测定吸光度值。

1.2.5 线性范围 称取可乐定盐酸盐标准品10 mg，溶于1 mL甲醇溶液中制备CLD储备液，放在4 ℃冰箱中备用。将储备液用磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L，pH7.2 PBS)稀释成 0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 ng/mL系列质量浓度，在最优抗原-酶标抗体工作浓度下，测定OD450值。各质量浓度所对应的抑制率I=B/B0×100%(B0对应0 ng/mL的OD值)，以CLD药物浓度对数为横坐标，抑制率为纵坐标做标准曲线。

1.2.7 抗体的特异性 可乐定试剂盒与常见的β-兴奋剂类，如莱克多巴胺、沙丁胺醇、克伦特罗等物质进行交叉反应，得出各种药物的半数抑制浓度(IC50)，然后计算交叉率，交叉率=IC50(可乐定)/IC50(其他药物)×100。

1.2.8 试剂盒的精密度和准确度 在空白猪尿样中分别添加0.15、0.2、0.5 ng/mL的可乐定标准品，每个浓度重复3次，对3批试剂盒进行测定，计算变异系数(CV)，以及计算回收率，回收率=实际测定的浓度/添加的浓度×100%。

1.2.9 试剂盒的符合性 对已确认的阴性样品中进行添加或不添加可乐定标准品进行测定，检测试剂盒的假阳性和假阴性，来评估它的符合性。

2 结 果

2.1 线性范围 以吸光值为纵坐标和质量浓度为横坐标绘成曲线图2，在0.1～8.1 ng/mL之间曲线呈指数形，图3是以吸光值B/B0的百分比值为纵坐标和质量浓度的对数为横坐标作图，表明此试剂盒在0.1～8.1 ng/mL范围呈良好的线性，对曲线进行线性回归得直线方程为y=-40.01x+42.84，相关系数R2=0.9777，半数抑制浓度IC50为0.675 ng/mL。

图2 在450nm下不同可乐定浓度吸光值Fig 2 Absorbance values of different clonidine concentration at 450nm

图3 可乐定浓度对数吸光度百分比Fig 3 Standard curve of clonidine-Kit

2.3 抗体的特异性 可乐定试剂盒与常见的β-兴奋剂类，例莱克多巴胺、沙丁胺醇、克伦特罗等物质的交叉情况检测结果见表1，表明可乐定试剂盒与β-兴奋剂类无交叉反应。

表1 可乐定抗体对其他药物的交叉反应率Tab 1 The percent cross reactivity of clonidine-Kit with beta-agonists

2.4 试剂盒的准确度和精密度 平均添加回收率及变异系数计算结果如表2所示，从表中看到可乐定药物在猪尿中的添加回收率在81%～109%之间；在批内、批间的变异系数3.7%～9.2%之间，表明该ELISA试剂盒具有良好的准确性和精密性。

2.5 试剂盒的符合性 从试剂盒的假阴性、假阳性测定以及仪器检测样品比对情况，评估其符合性。

2.5.1 假阴性率 在已确认的阴性样品中添加不同浓度的可乐定标准品，评价试剂盒的假阴性。添加6份样本，测定结果见表3，均为阳性，未发现假阴性。

表2 准确度和精密度测定结果Tab 2 Recovery test of clonidine added to sample by clonidine-Kit

表3 可乐定的试剂盒假阴性评价结果Tab 3 False negative result of clonidine -Kit ng/mL

2.5.2 假阳性率 取20份经仪器确认的阴性尿样，试剂盒测定结果浓度低于0.1 ng/mL的有18份，浓度低于0.2 ng/mL的有2份，结果判定均为阴性，未出现假阳性。

2.5.3 与仪器测定进行比对 取50份空白猪尿样品，随机添加可乐定标品，制得50份盲样，分别采用ELISA试剂盒和液相色谱-串联质谱进行测定，仪器方法参照文献[10]所述进行操作。经检测40份样品确认为阴性，10份检测结果大于0.2 ng/mL，判定为阳性，ELISA检测结果与液相色谱-串联质谱检测结果相符，表明此试剂盒的符合性高。

3 讨 论

3.1 包被抗原-可乐定抗体-酶标二抗工作浓度选择 采用方阵试验法对间接竞争ELISA法中包被抗原、可乐定抗体和酶标二抗的稀释度进行筛选并确定工作浓度，工作浓度优化根据实际使用时阴性样的检测OD450为2.0左右原则进行调试。将HRP-羊抗兔IgG分别作1︰3000、1︰4000、1︰5000和1︰6000倍稀释，用包被好的ELISA板测其0D值，选择最合适酶标二抗浓度和包被浓度。通过方阵试验得到最优浓度组合为：抗原包被浓度为1～2 μg/mL，可乐定抗体浓度为10 μg/mL，酶标二抗稀释比1︰5000，此时的OD450值2.1左右。

3.2 试剂盒的性能 关键影响因素抗体的特异性和效价决定了试剂盒的性能，这两点又和免疫抗原及免疫方式相关，本研究在不改变可乐定分子结构特征基础上进行接臂，通过臂上基团偶联到载体蛋白上，以避免载体蛋白(BSA或OVA)掩蔽可乐定小分子的抗原性，提高免疫效果和效价。在免疫方式上采用抗原和弗氏完全佐剂及不完全佐剂联合应用，适当减少每次免疫剂量，采用小剂量延长免疫周期方式来提多克隆抗体的效价和特异性。

本研究建立了竞争ELISA试剂盒，经性能分析测试，证明此试剂盒具有特异性好、准确性和重复性高等特点，适用于对动物尿样、血清和组织中的可乐定残留快速检测，为可乐定残留的监控提高了灵敏高、准确性好、快速便捷的检测方法。

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(编辑：李文平)

Development and Performance Measurement of Clonidine ELISA Test Kit

LI Dan-ni1, GU Xin1, HUANG Hua2, LU Pei-si2, WANG Xue-sheng2, HUANG Shi-xin1*

(1.Shanghai Muncipal Institute of Veterinary Drug and Feedstuff Control, Shanghai 201103, China；2.Rohi Biotechnology Co.Ltd, Shanghai 200231, China)

HUANG Shi-xin, E-mail: yure@yeah.net

An indirect competitive ELISA assay with preparing specific anti-clonidine polyclonal antibody was developed for the rapid detection of clonidine in the animal urine. The results showed that the logarithm of clonidine concentration with the absorbance percentage shows a linear relationship between 0.1～8.1 ng/mL, the correlation coefficientR2is 0.977, the half inhibitory concentration (IC50) is 0.675 ng/mL, the detection limit for the clonidine assay is 0.159 ng/mL, the sample recovery is 81%～109%, the variation coefficient is 3.7%～9.2%. This assay exhibits good specificity with no any cross reactions to β-agonists. It could be used as rapid detection for the residual clonidine in the samples such as animal urine, serum and tissues.

clonidine; competitive ELISA; polyclonal antibody; test kit

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.8.07

国家公益性行业(农业)科研专项(201203023)；上海市科技兴农重点攻关项目[沪农科攻字(2014)第3-3号]

李丹妮，高级畜牧师，从事兽药残留检测与方法开发。

黄士新。E-mail:yure@yeah.net

2017-01-28

A

1002-1280 (2017) 08-0040-06

S859.84