牛乳头状瘤病毒2型贵州株L2基因克隆及生物信息学分析

张海，杨丽彦，张军，冯旭芳，周碧君*，王开功，文明，程振涛，王伟，胡兴义

(1.贵州大学动物科学学院，贵阳 550025；2.贵州轻工职业技术学院，贵阳 550025；3.贵州省六盘水市动物卫生监督所，贵州六盘水 553001；4.贵州省德江县动物疫病预防控制中心，贵州德江 565200)

牛乳头状瘤病毒2型贵州株L2基因克隆及生物信息学分析

张海1，杨丽彦2，张军3，冯旭芳4，周碧君1*，王开功1，文明1，程振涛1，王伟1，胡兴义1

(1.贵州大学动物科学学院，贵阳 550025；2.贵州轻工职业技术学院，贵阳 550025；3.贵州省六盘水市动物卫生监督所，贵州六盘水 553001；4.贵州省德江县动物疫病预防控制中心，贵州德江 565200)

为分析牛乳头状瘤病毒2型贵州株(BPV2-GZ01株)L2基因的分子特征，预测编码蛋白的生物学功能，对BPV2-GZ01株L2基因进行PCR扩增、克隆及序列测定，应用生物信息学相关软件及方法，对BPV2-GZ01株L2基因进行序列分析并对其编码蛋白进行二级结构、三级结构、B细胞表位、保守结构域、跨膜结构域和信号肽预测。结果显示，L2基因PCR扩增产物大小为1404 bp，编码467个氨基酸；与参考株BPV2株、BPV2-SW01株、BPV2-AKS01株、BPV13株、BPV1株相应序列核苷酸同源性分别为99.0%、99.7%、99.3%、83.9%和75.1%，氨基酸的同源性分别为98.9%、99.6%、99.4%、89.5%和82.7%；系统进化显示，BPV2-GZ01株L2基因与BPV2-SW01株亲缘关系最近；二级结构以无规则卷曲、β-折叠和α-螺旋区域所占比例较大，预测此蛋白可能存在B细胞优势抗原表位，无跨膜区域，无信号肽区域。本研究结果将为贵州省BPV核酸疫苗研究提供理论依据。

牛乳头状瘤病毒2型；贵州株；L2基因；生物信息学分析

牛乳头状瘤是由牛乳头瘤病毒(Bovine papillamavirus, BPV)引起的一种体表或部分黏膜发生的慢性增生性疾病，称为“疣”[1-2]，是牛常见的良性肿瘤疾病。BPV颗粒是直径为55～60 nm的正二十面体，为无囊膜病毒，长度约为7000～8000 bp的双链闭环超螺旋DNA分子[3]，是乳头瘤病毒家族的成员。目前已知的有14个型基因型，还有很多假定基因型[4]。BPV L区主要有两个开放阅读框(ORF)L1和L2，分别编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2。L2蛋白大小约为63～78 ku，在感染细胞的胞浆中合成后迅速转运到细胞核，参与BPV的包装。L2蛋白相对保守，其上含很多有特异性的抗原表位，可诱与不同型别的BPV抗体产生交叉中和反应，因此有学者认为针对这些抗原位点的基因疫苗可能对广泛的乳头瘤病毒类型产生预防的作用[5-6]。本试验对牛乳头状瘤病毒2型贵州株(BPV2-GZ01株)L2基因进行了克隆和测序分析，并与国内外不同毒株进行同源性比对，绘制系统进化树，分析不同毒株间的亲缘关系，以阐明BPV2-GZ01株L2基因的分子特点；采用生物信息学软件对L2基因编码蛋白进行了蛋白质理化性质、B细胞表位、保守结构域、跨膜结构域、信号肽、二级结构和三级结构预测，以丰富当前BPV贵州流行株的生物信息学特征。

1 材料与方法

1.1 材料 牛乳头状瘤病毒2型贵州株(BPV2-GZ01株)阳性病料、大肠杆菌DH5α感受态细胞均由贵州大学动物疫病研究所保存；pMD19-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司；2×Taq PCR MasterMix、DNA Marker、DNA提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒购自上海生物工程公司；氨苄青霉素购自北京鼎国生物技术有限责任公司。

1.2 引物设计与合成 下载GenBank公布的各型BPV2衣壳蛋白L2基因序列进行序列比对和分析，选择较为保守的区域设计1对引物序列，上游引物P1：5'-ATGAGTGCACGAAAAAGGGTG-3'；下游引物P2：5'-TTAGGCATCTTTCCGTTTTTTTC-3'；预期扩增片段长1404 bp，引物由上海英潍捷基公司合成。

1.3 BPV2-GZ01株L2基因扩增 采用DNA提取试剂盒抽提病毒DNA，以此模板，进行PCR扩增。PCR反应体系50 μL：上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，2×Taq PCR MasterMix 25 μL，模板2 μL，灭菌双蒸水19 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃终延伸10 min。扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶电泳上检测。

1.4 BPV2-GZ01株L2基因克隆及序列分析 回收纯化目的DNA并连接至pMD19-T载体上，再转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，利用含氨苄青霉素(100 μg/mL)抗性的LB平板筛选阳性重组子。提取质粒，进行PCR鉴定。将产物于1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定为阳性的重组质粒命名为pMD19-T-L2，送往赛默飞世尔科技(中国)有限公司测序。利用DNAStar、Mega 5.0等软件对测序结果进行分析，并绘制系统进化树。参考毒株信息见表1。

1.5 BPV2-GZ01株L2基因生物信息学分析 采用在线软件ExPASy(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)分析预测编码蛋白质的理化性质及氨基酸组成。采用SPOMA在线服务器(https: //npsa-prabi.ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=/NPSA/ npsa_sopma. html)预测蛋白质二级结构；采用DNAStar软件Protean程序预测B细胞表位多参数；采用NCBI服务器上的Conserved Domain Architecture Retrieval Tool (CDART)工具(http://blast .ncbi. nlm.nih.gov.Blast)预测保守结构域；采用TMHMM2.0 Server在线服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)预测跨膜结构域；采用SignalP4.1在线服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号肽。利用SWISSMODEL(http://www.swissmodel.expasy.org)在线预测蛋白质的三级结构。

2 结果与分析

2.1 BPV2-GZ01株L2基因PCR扩增 以提取的BPV2-GZ01株病毒DNA为模板，进行L2基因特异性PCR扩增，经1.2%琼脂糖凝胶电泳分析，得到大小为1 404 bp的条带(图1)，与预期结果相符。

2.2 测序结果 将鉴定的阳性重组质粒进行测序，测序结果采用DNAStar软件进行序列拼接，获得BPV2-GZ01株L2基因核苷酸序列，由图2可知，L2基因核苷酸序列长为1404 bp，编码467个氨基酸。

M：DL2000 DNA Marker；1-2：扩增产物；3: 阴性对照M: DL2000 DNA Marker；1-2: Amplification products；3: Negative control图1 BPV2-GZ01株L2基因PCR扩增电泳图Fig 1 Amplification of L2 gene of BPV2-GZ01 by PCR

2.2.1 BPV2-GZ01株L2基因核苷酸同源性分析

将本试验克隆的BPV2-GZ01 L2基因序列与GenBank上公布的16株牛乳头状瘤病毒L2基因的对应序列进行核苷酸比对分析(图3)。

结果显示，BPV2-GZ01 L2基因序列与牛乳头状瘤病毒2型的核苷酸序列同源性为99.0%～99.7%，其中与BPV2-SW01(登录号：KC878306)的同源性最高达到99.7%；与NCBI收录的另外两株BPV13(登录号：JQ79817)、BPV1(登录号：X02346)的同源性分别为83.9%、75.1%。

图2 BPV2-GZ01株L2基因测序结果Fig 2 Secquencing result of L2 gene of BPV2-GZ01

图3 BPV2-GZ01株L2基因的核苷酸同源性分析Fig 3 Nucleotide homology analysis of L2 gene of BPV2-GZ01

2.2.2 BPV2-GZ01株L2基因编码蛋白的氨基酸同源性分析 采用DNAStar软件分析出BPV2-GZ01 L2基因的氨基酸序列，并与GenBank中公布的16株牛乳头状瘤病毒L2基因编码氨基酸序列作同源性分析(图4)。结果显示，BPV2-GZ01 L2基因氨基酸序列与牛乳头状瘤病毒2型的氨基酸序列同源性为98.7%～99.6%，其中与BPV2-ASK01(登录号：KC878306)的同源性最高达到99.6%；与NCBI收录的另外两株BPV13(登录号：JQ79817)、BPV1(登录号：X02346)的同源性分别为89.5%、82.7%。

2.2.3 BPV2-GZ01株L2基因系统进化树分析 将BPV2-GZ01株L2基因与国内外发表的BPV不同毒株L2基因的核苷酸序列采用DNAStar软件绘制遗传进化树。结果显示，BPV2-GZ01株与BPV2、BPV2-SW01、BPV2-AKS01株都处在同一遗传进化分支(图5)，其中BPV2-SW01株的亲缘关系最近。BPV2-GZ01株与BPV13和BPV1的亲缘关系较近。

图4 BPV2-GZ01株L2基因编码蛋白的氨基酸同源性分析Fig 4 Amino acid homology analysis of L2 gene of BPV2-GZ01

图5 BPV2-GZ01株L2基因核苷酸序列的系统进化树Fig 5 Phylogenetic tree of L2 gene BPV2-GZ01 on nucleotide sequence

2.3 BPV2-GZ01株L2蛋白质理化性质的分析 使用ExPASy(Compute PI/MW)、ProtParam在线分析软件预测蛋白质的理化性质及氨基酸组成。L2蛋白分子质量为49.41127 ku，分子结构式为C2183H3456N596O702S4，理论等电点(PI)为4.85。其氨基酸组成中Gly(G)和Leu(L)最多，均占到9.1%以上，不含Pyl(0)和Sec(U)。在该蛋白的氨基酸中，碱性氨基酸有3种(Arg、Lys、His)，共45个，占9.6%；酸性氨基酸有2种(Asp、Glu)，共56个，占12%；亲水性氨基酸有6种(Asp、Glu、His、Lys、Ser、Thr)，共159个，占34.1%；疏水性氨基酸9种(Ala、Ile、Pht、Leu、Met、Pro、Val、Trp、Tyr)，共207个，占44.33%，推测L2蛋白为碱性蛋白。L2蛋白在哺乳动物网状细胞、酵母和埃希氏大肠杆菌中表达的半衰期分别大于30 h、20 h和10 h，在溶液中的不稳定指数为43.74，高于阈值40，属于不稳定类蛋白[7]。

2.4 BPV2-GZ01株L2基因B细胞表位预测

2.4.1 L2基因编码蛋白二级结构预测 采用SOPMA在线服务器预测L2基因编码蛋白的二级结构，结果见图6。BPV2-GZ01株L2基因编码蛋白的二级结构主要包括α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和β-折叠，所占比例分别为19.06%、8.78%、49.89%和22.27%。在整个蛋白二级结构中无规则卷曲、β-折叠和α-螺旋区域出现相对较多，而此序列中β-转角所占比例相对较少。

2.4.2 L2基因编码蛋白B细胞多参数分析 采用DNAStar程序包中的Protean软件综合分析预测L2基因编码蛋白B细胞表位各参数。采用Kyte-D00little法分析亲水性，Karplus-Schulz法分析柔韧性Jameson-Wolf法分析抗原指数和Emini法分析氨基酸表面可及性进行分析，以高于阈值的氨基酸残基作为候选参考区域，结果见图7。由图可知，该蛋白在整个氨基酸区域中，都具有良好的亲水性，柔韧性分布较均匀，抗原性和表面可及性较高。

h：α-螺旋；t：β-转角；c，无规则卷曲；e：β-折叠h：Alpha helix；t：Beta turn；c：Random coil；e：Extended strand图6 BPV2-GZ01 L2基因编码蛋白二级结构预测Fig 6 Secondary structure prediction of BPV2-GZ01 L2 protein

图7 BPV2-GZ01 L2蛋白B细胞表位参数预测Fig 7 B cell epitope prediction for L2 protein of BPV2-GZ01 by the DNAStar method

2.5 BPV2-GZ01株L2基因编码蛋白保守结构域预测 采用NCBI服务器上的CDART工具分析L2基因氨基酸序列保守结构域，没有发现具有明显特征的保守结构域(图8)。

图8 BPV2-GZ01 L2基因编码蛋白保守结构域分析Fig 8 Conserved domain analysis of L2 protein of BPV2-GZ01

2.6 BPV2-GZ01株L2基因编码蛋白的跨膜结构预测 采用TMHMM2.0 Server在线服务器对L2蛋白跨膜结构域进行预测和分析。图9结果显示，BPV2-GZ01 L2基因编码蛋白有跨膜结构域。

图9 L2蛋白跨膜结构域预测Fig 9 Prediction of trans membrane domains of L2 protein

2.7 BPV2-GZ01株L2基因编码蛋白信号肽预测

采用SignalP4.1在线服务器对L2蛋白序列中是否存在潜在的信号肽进行预测。预测结果显示，此蛋白无信号肽(图10)，即为非分泌蛋白。

图10 L2蛋白信号肽预测Fig 10 The signal peptide analysis of L2 protein

2.8 L2基因编码蛋白三级结构预测 利用SWISS-MODEL预测了L2基因编码蛋白的三级结构，结果见图11。

图11 BPV2-GZ01 L2基因编码蛋白三级结构预测Fig 11 Tertiary structure prediction of BPV2-GZ01 L2 protein

3 讨 论

近年来，贵州省极力打造生态畜牧业大省，其中养牛业为重点发展项目之一，为加快肉牛品改进程，从2015年来先后向国外和省外引进了大量优质种牛，以快速发展养牛业，自从2016年初发现BPV以来犊牛的发病率有逐渐上升的趋势，对养牛业造成了较大的经济损失。由于BPV种属特异性高，难以进行体外培养[8]。BPV基因型很多，不同的基因型引起临床发病的部位各不相同[9-10]。到目前为止依旧没有有效的的疫苗来预防牛乳头状瘤病的发生[10-12]。以抗原表位为基础的表位疫苗具有针对性强，毒副作用小等优点已成为疫苗研制的热点和趋势[13]。而利用生物信息学的方法对抗原表位的预测也是较为实用、简便的方法之一[14]。因此BPV2-GZ01株L2基因的生物信息学分析对BPV疫苗的研究有非常重要的意义。

本研究根据GenBank公布的牛乳头状瘤病毒2型L2基因序列，设计特异性引物，从BPV2-GZ01株中克隆该基因，经质粒鉴定及DNA测序验证克隆成功。本研究测序结果显示，BPV2-GZ01基因序列全长为1404 bp，编码467个氨基酸。BPV2-GZ01株L2基因与NCBI收录的16株毒株核苷酸和氨基酸同源性分析，BPV2-GZ01 L2基因序列与其中3株牛乳头状瘤病毒2型核苷酸和氨基酸序列同源性高达99.0%～99.7%和98.7%～99.6%，其中与BPV2-SW01同源性最高，为99.7%和99.6%；与NCBI收录的另外2株BPV13、BPV1的核苷酸和氨基酸同源性分别为83.9%、75.1%和89.5%、82.7%。从系统进化树可以看出，BPV2-GZ01株与BPV2-SW01亲缘关系最近，与BPV13、BPV1和BPV14的亲缘关系也比较近，同属于Delt属。

BPV2-GZ01株L2蛋白二级结构预测结果显示，无规则卷曲和β-折叠占70.16%，β-转角和α-螺旋占29.84%。蛋白质的二级结构是抗原表位的基础，ɑ螺旋和β折叠不适合做抗原表位，该结构具有稳定高、不易变形的特性，因此是构成蛋白质骨架的主要结构；而转角和无规则卷曲形成抗原表位的可能性增加，因为该结构易发生扭曲和盘旋[15]。当然预测一个蛋白的生物学特征时，单一参数的预测结果正确率往往是很有限的，还需综合考虑跨膜结构、信号肽、亲水性、表面可及性、抗原指数及柔韧性等预测结果来作出分析[16]。随着生物信息学技术的不断发展，比较全面的预测蛋白质的生物学特征已成为可能。L2蛋白氨基酸的亲水性、表面可及性、抗原指数及柔韧性均较高，提示该蛋白具有较好的免疫原性，可初步应用于免疫学的相关研究中。综合保守结构域、信号肽和跨膜结构域分析发现，BPV2-GZ01 L2蛋白无特征性功能结构域和信号肽，有跨膜结构域，即L2蛋白为二次跨膜蛋白和非分泌型蛋白[17]。氨基酸的二级结构是高级结构的基础，同时也对高级结构的形成产生一定的影响[18-19]。通过蛋白质的三级结构预测为BPV2-GZ01 L2基因抗原表位的分析提供了更为直观的分子模型，增加了B细胞抗原表位预测的可靠性。以上的试验和模拟数据为进一步解析该基因功能打下坚实的理论基础和支撑，对后期基因表达和核酸疫苗研制的研究提供试验参考。

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(编辑：李文平)

Cloning and Bioinformatic Analysis of L2 Gene of BPV2 from Guizhou Province

ZHANG Hai1, YANG Li-yan2, ZAHGN Jun3, FENG Xu-fang4, ZHOU Bi-jun1*, WANG Kai-gong1, WEN Ming1, CHENG Zhen-tao1, WANG Wei1, HU Xing-yi1

(1.College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang, 550025, China；2.Guizhou Light Industry Vocational and Technical College Guiyang, 550025, China; 3.Animal Health Supervision Institute of Liupanshui City, Lupanshui, Guizhou, 553001, China；4.Dejiang County Animal Disease Prevention and Control Center, Dejiang, Guizhou 565200, China)

ZHOU Bi-jun, E-mail：as.bjzhou@gzu.edu.cn

In order to study and analyze the L2 gene of Bovine papillamavirus 2 in Guizhou province, the L2 gene of BPV2-GZ01 strain was amplified, cloned and sequenced using bioinformatic softwares and methods, the secondary structure, tertiary structure, B-cell preponderant epitope, conserved domains analysis, transmembrane domain and signal peptide of L2 gene were predicted. The results indicated the length of L2 gene was 1404 bp, encoding 467 amino acids. The L2 gene of BPV2-GZ01 strain shared a nucleotide identities of 99.0%、99.7%、99.3%、83.9% and 75.1%, and an amino acid identities of 98.9%、99.6%、99.4%、89.5% and 82.7% with those of strains BPV2, BPV2-SW01, BPV2-AKS01, BPV13 and BPV1, respectively. The results of phylogenetic tree analysis indicated that there was a close relationship between BPV2-GZ01 strain and BPV2-SW01. Prediction of the secondary structure of L2 indicated that the random coil, extended strand and alphahelix took a higher percentage. The L2 protein was supposed contain antigen epitopes, and have a transmembrane domains, no signal peptide found. Tertiary structure is curved spiral structure. These results provided a theoretical basis for further research of nucleic acid vaccine of BPV.

Bovine papillamavirus 2(BPV2)；Guizhou strain；L2 gene；bioinformatics analysis

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.8.03

贵州省黔南州社会发展科技重大计划项目[黔南社发科(20140325)]；贵州省农业委员会科技专项(黔农财[2015]149号)

张海，硕士研究生，从事动物传染病学研究。

周碧君。E-mail: as.bjzhou@gzu.edu.cn

2017-03-30

A

1002-1280 (2017) 08-0014-09

S852.65