分散固相萃取法结合液相色谱串联质谱法检测鸡可食性组织中泰万菌素及3-乙酰泰乐菌素残留量

吴剑平，张婧，李丹妮，严凤，潘娟

(上海市兽药饲料检测所，上海 201103)

分散固相萃取法结合液相色谱串联质谱法检测鸡可食性组织中泰万菌素及3-乙酰泰乐菌素残留量

吴剑平，张婧，李丹妮*，严凤，潘娟

(上海市兽药饲料检测所，上海 201103)

建立了检测鸡肉、鸡皮脂、鸡肝和鸡蛋中泰万菌素以及其主要代谢产物3-乙酰泰乐菌素残留量的液相色谱串联质谱方法。前处理使用分散固相萃取法，选择使用50%(V/V)乙腈提取，无水MgSO4进行脱水和盐析，正己烷脱脂，酸性氧化铝粉末进行样品净化。将离心后的上清液以如下方法进行上机检测：使用反相色谱柱进行分离，流动相为0.1%甲酸和乙腈，采用梯度程序进行洗脱，三重四级杆质谱进行定性定量分析。实验结果表明，方法的最低检出限为2.5 μg/kg，最低定量限为5 μg/kg，在5～200 μg/kg范围内线性关系良好(r>0.995)，添加回收率在60%～110%，RSD<20%，表明该方法具有较好的准确度与精密度。

泰万菌素;3-乙酰泰乐菌素; 分散固相萃取; 串联质谱法

泰万菌素(Tylvalosin)是新一代的大环内酯类抗生素[1]，常作为酒石酸盐使用，即酒石酸泰万菌素(Tylvalosin Tartrate)。该产品在2007年之前曾用名是酒石酸乙酰异戊酰泰乐菌素(Acetylsivaleryltylosin Tartrate，简称AIV)。泰万菌素是一种畜禽专用的抗生素，通过抑制细菌蛋白质的合成从而抑制细菌的繁殖，其在中国已被注册批准用于治疗猪、鸡支原体感染和猪赤痢螺旋体以及其他敏感细菌的感染，其批准用药剂量为每1 L水添加200 mg(有效成分)，连用3～5 d；酒石酸泰万菌素预混剂的批准用药剂量为每1000 kg饲料添加100～300 g(有效成分)，连用7 d[2]。泰万菌素可在动物体内经代谢后以原药和3-乙酰泰乐菌素(3-O-Acetyltylosin，简称3-AT)的形式残留在肝脏和皮脂中[3]。欧盟对泰万菌素的使用有严格规定[4]，泰万菌素和3-乙酰泰乐菌素在鸡皮/脂肪、鸡肝和鸡蛋中的最大残留限量(MRL)之和不得超过50 μg/kg，两者的MRL分别不得超过25 μg/kg。泰万菌素和3-乙酰泰乐菌素基本化学结构见图1。

固相萃取技术已被广泛应用于各种残留检测领域，其具有简便快捷、特异性好等特点。据文献报道[5-8]，常用的固相萃取主要有分散固相萃取和填料柱固相萃取这两种方式，通过这些手段可以达到去除试样中的干扰物质，使痕量组分得到富集，便于检测和分离，保护色谱分析柱等目的。相比传统填料柱固相萃取，分散固相萃取具有节省人力和时间，提高前处理稳定性和降低耗材成本的优势。

泰万菌素Tylvalosin

3-乙酰泰乐菌素3-O-Acetyltylosin图1 泰万菌素和3-乙酰泰乐菌素基本化学结构图Fig 1 Structure of Tylvalosin and 3-O-Acetyltylosin

1 材料与方法

1.1 仪器 Ultimate 3000双三元超高效液相色谱、Excalibur控制软件、串联四极杆质谱带HESI电离喷雾源(TSQ Quantiva)、Xcalibur数据处理系统、高速冷冻离心机(Allegra X-22R，BECKMAN COULTER)；AL204电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；减压旋转蒸发仪(B-490，BUCHI)；水浴控温氮吹仪(N-EVAP，上海安谱公司)。

1.2 材料、药品与试剂 C18分析柱(Thermo Accucore RP-MS 100 mm×2.1 mm， 2.6 μm)，泰万菌素对照品(英国伊科拜克，批号：130503，93.69%)，3-乙酰泰乐菌素对照品(英国伊科拜克，批号：Q3317，96.54%)，无水硫酸镁(分析纯)，氯化钠(分析纯)，正己烷(色谱纯)，乙腈(色谱纯)，酸性氧化铝(100～200目)，乙腈、甲醇、甲酸(色谱纯)；去离子水(电阻率≥18 MΩ·cm)；高纯氮、高纯氩(纯度均为99.999%)。

1.3 色谱条件 色谱柱：Thermo Accucore RP-MS 100 mm×2.1 mm，2.6 μm，柱温35 ℃，流速0.3 mL/min，进样量10 μL，流动相：A为0.1%甲酸，B为乙腈，采用梯度洗脱程序如表1所示，所得特征离子质量色谱图如图2。从上至下通道依次为泰万菌素和3-乙酰泰乐菌素。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Procedure of gradient elution

1.4 质谱条件 使用Thermo Fisher公司的TSQ Quantiva串联四极杆质谱带HESI电离喷雾源质谱检测器对1 μg/mL的泰万菌素和3-乙酰泰乐菌素单标溶液进行优化，兼顾各目标化合物优化后的质谱条件为：选择正离子模式，源电压3900 V，鞘气(Sheath gas)压力344 kPa，辅助气(Aux gas)流速5 L/min，吹扫气(Sweep gas)流速0.3 L/min，离子传输管(Ion transfer tube)温度 350 ℃，雾化器(Vapourizer)温度350 ℃，检测模式为选择反应监控(Selected reaction monitor，SRM)，碰撞气压力0.2 Pa，Q1段分辨率设为半峰宽0.7，Q2段分辨率设为半峰宽0.7，泰万菌素和3-乙酰泰乐菌素的定性与定量离子对以及对应的撞击能量见表2。

图2 1 ng/mL混合对照品溶液SRM图Fig 2 SRM chromatography of 1 ng/mL mixed standard solution

化合物Compound定性离子对Qualitativeionpair(m/z)定量离子对Quantitativeionpair(m/z)透镜电压Lensvoltage/V碰撞能量Collisionenergy/eV泰万菌素Tylvalosin1042.60>109.061042.60>174.131042.60>109.0618548453-乙酰泰乐菌素3-O-Acetyltylosin958.52>174.11958.52>814.40958.52>174.111814432

1.5 样品前处理 取2.00 g样品置于50 mL试管中，加入50%乙腈溶液10 mL，涡旋混匀后加入10.00 mL正己烷和无水硫酸镁与氯化钠各2 g，振荡提取10 min，8000 r/min离心5 min，用注射器准确吸取中间乙腈层清液1.00 mL至离心管中备用。准确移取0.50 mL备用液，加入0.50 mL 20 mM酒石酸溶液和0.20 g酸性氧化铝粉末，涡旋均匀后12000 r/min离心3 min，取上清液过0.22 μm尼龙滤膜后，装入棕色进样瓶上机测定。

2 结果与分析

2.1 线性定量范围 将泰万菌素和3-乙酰泰乐菌素对照品分别用甲醇溶解制成1 μg/mL的标准品贮备液，取适量该贮备液用20 mM酒石酸溶液稀释成0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/L的标准曲线系列工作溶液，将该系列溶液依次按1.4项和1.5项的检测方法进样检测，将所得定量通道色谱图积分后，面积与内标峰面积比值以Y表示，进样浓度以X表示，所得回归曲线结果如下表3所示，其线性相关系数r都大于等于0.995。实验表明，该方法同时检测泰万菌素和3-乙酰泰乐菌素进样浓度在0.5 μg/kg～20 μg/L，即实际含量在5～200 μg/kg范围内线性良好。

表3 泰万菌素和3-乙酰泰乐菌素标准曲线Tab 3 Standard curve of Tylvalosin and 3-O-Acetyltylosin

2.2 方法灵敏度 分别取鸡肉、鸡皮/脂、鸡肝和鸡蛋进行实验，空白试料按1.3～1.5项相同的步骤处理后，进行测定。测定结果表明：在相应的保留时间，空白试料对所测药物无干扰。定量限(LOQ)：添加适量的1 μg/mL的混合标准溶液于2 g空白试样中，按1.3～1.5项操作步骤处理后上机测定，所得特征离子质量色谱图见图3，依据信噪比S/N>10(按PtP算)，确定泰万菌素和3-乙酰泰乐菌素的最低定量限为5 μg/kg，最低检测限为2.5 μg/kg。

(a)空白鸡肉添加5 μg/kg；5 μg/kg added in blank muscle;(b)空白鸡皮/脂肪添加5 μg/kg；5 μg/kg added in blank skin/fat;(c)空白鸡肝添加5 μg/kg；5 μg/kg added in blank liver;(d)空白鸡蛋添加5 μg/kg 5 μg/kg added in blank egg图3 泰万菌素和3-乙酰泰乐菌素实际添加实验特征离子质量色谱图Fig 3 Typical SRM chromatogram of Tylvalosin and 3-O-Acetyltylosin added in tissues

2.3 方法准确度与精密度 采用标准添加法，在鸡皮、鸡肉、鸡肝和鸡蛋中添加4个不同浓度(定量限、1/2MRL、MRL、2MRL四个浓度)的泰万菌素和3-乙酰泰乐菌素进行回收率试验，各浓度进行3个批间样品平行试验，批内重复5次，求批内、批间相对标准偏差，计算结果见表4～表7。从表中试验结果可以看出，本方法在空白鸡皮、鸡肉、鸡肝和鸡蛋中进行5～50 μg/kg的添加浓度，方法的回收率均在60%～120%之间，批内、批间相对标准偏差均小于20%。

2.4 方法选择性的验证 选择空白鸡皮、鸡肉、鸡肝和鸡蛋各20个空白样品，按优化条件进行处理后上机测定，未发现有假阳性结果，表明该方法的选择性良好。

表4 鸡皮中泰万菌素和3-乙酰泰乐菌素添加回收率及精密度(n=5)Tab 4 Recovery and precision of Tylvalosin and 3-O-Acetyltylosin added in chicken skin/fat(n=5)

表5 鸡肉中泰万菌素和3-乙酰泰乐菌素添加回收率及精密度(n=5)Tab 5 Recovery and precision of Tylvalosin and 3-O-Acetyltylosin added in chicken muscle(n=5)

表6 鸡肝中泰万菌素和3-乙酰泰乐菌素添加回收率及精密度(n=5)Tab 6 Recovery and precision of Tylvalosin and 3-O-Acetyltylosin added in chicken liver(n=5)

续表

表7 鸡蛋中泰万菌素和3-乙酰泰乐菌素添加回收率及精密度(n=5)Tab 7 Recovery and precision of Tylvalosin and 3-O-Acetyltylosin added in chicken egg(n=5)

续表

3 讨论与小结

3.1 提取液提取效率研究 试料中的残留药物尝试了多种提取液，包括纯乙腈、50%乙腈、正己烷、异辛烷。2 g空白试样中加入100 ng/mL的泰万菌素和3-乙酰泰乐菌素标准工作液250 μL分别加入上述提取液进行振荡提取，之后采用1.5项中前处理条件进行净化，测得结果如表8所示，测试结果表明两种药物极性偏大，在50%乙腈溶液中的提取效率接近90%，在正己烷或异辛烷这类极性小的溶剂中几乎不溶，因此选择50%乙腈进行提取，正己烷进行脱脂。无水硫酸镁盐析除去杂质蛋白，取适量中间乙腈层提取液，用20 mM酒石酸稀释后，再用酸性氧化铝除去剩余脂肪与蛋白后，进液相色谱-串联质谱法检测，用外标法定量。

表8 泰万菌素和3-乙酰泰乐菌素提取效率研究Tab 8 Research on extraction rate of Tylvalosin and 3-O-Acetyltylosin

3.2 分散相基质的选择 鸡肉和鸡蛋中的干扰杂质主要以蛋白质和磷脂为主，主要通过无水硫酸镁和氯化钠进行盐析，其对基质中的血细胞之类的生物杂质也有一定的破坏和沉降能力。乙腈在提取的同时也具有破坏蛋白质结构造成沉淀的作用。皮脂和肝脏中不但有蛋白质，还有大量的脂肪会干扰后续的检测，原本尝试使用C18粉末吸附，结果发现在吸附脂肪的同时，会造成提取效率的大幅下降，推测是C18粉对目标化合物也有较强的吸附能力，因为在3.1项实验发现正己烷中泰万菌素和3-乙酰泰乐菌素溶解性都很小，而脂肪在其中的溶解度较高，因此采用正己烷脱脂。最后，通过高速离心可以将蛋白、磷脂、血细胞等沉降至下层，未溶解的脂肪粒会漂浮在正己烷层的表面，只要吸取中间的乙腈层即可获得富含目标物的提取液。

3.3 色谱条件的选择 通过选择具有更好保留性和选择性的色谱条件可以使目标化合物获得充分的保留与分离，本方法的目标化合物属于中弱极性，因此选择反相色谱柱进行分离较为合适，比较了Thermo公司装填的两款反相色谱柱：Accucore RP-MS 150×2.1 mm 2.6 μm和Syncronis C18 150×2.1 mm 3.0 μm。实验结果表明，使用Accucore RP-MS色谱柱的目标物峰普遍具有保留时间不足、峰型对称性不高的特点，推测其原因为所使用的聚合物性质填料含碳量接近10%，虽然通过壳层技术增加了填料的比表面积，但并不能提供很好的保留；Syncronis C18色谱柱的硅胶键合填料含碳量接近17%，为目标化合物提供了足够的保留。流动相条件也进行了新的尝试，原本欧盟方法所使用的流动相为：水相采用0.3%甲酸-乙酸铵溶液，有机相为0.3%甲酸甲醇溶液，经试验发现该流动相在进行梯度洗脱条件时会造成较高的色谱柱反压，容易发生质谱仪毛细管喷针处的结晶析出造成堵塞或液流不稳定。因此，将流动相条件改为使用水相为0.1%甲酸，有机相改为乙腈溶液，在梯度条件下柱压变化明显减小，毛细管喷针也不易发生堵塞，所获得的保留时间与峰型也可以满足检测要求。

本研究建立了检测鸡肉、鸡皮脂、鸡肝和鸡蛋中泰万菌素与3-乙酰泰乐菌素残留量的液相色谱串联质谱检测方法。前处理使用分散固相萃取法，液相部分使用反相色谱柱进行分离，三重四级杆质谱进行定性定量分析。实验结果表明，方法的最低检出限为2.5 μg/kg，最低定量限为5 μg/kg，在5～200 μg/kg范围内线性关系良好(r>0.995)，添加回收率在60%～110%之间，RSD<20%，表明该方法具有较好的灵敏度、准确度与精密度。

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(编辑：侯向辉)

Determination of Aivlosin and 3-Acetyl Tylosin in Edible Chicken Tissues by Dispersive Solid Phase Extraction Combined with Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WU Jian-ping, ZHANG Jing, LI Dan-ni*, YAN Feng, PAN Juan

(Shanghai Municipal Supervisory Institute Veterinary Drugs and Feedstaff, Shanghai 201103, China)

Li Dan-ni, E-mail: yure@sina.com

To determine residue of tylvalosin (TLV) and 3-acetyl tylosin (3-AT) in edible chicken tissues such as muscle, skin/fat, liver and egg, a dispersive solid phase extraction method was used to process the sample. The 50%(V/V) acetonitrile was chosen to extract the target compounds, the anhydrous magnesium sulfate was chosen to dehydrate and salt out, the n-hexane was chosen to degrease and the acid alumina powder were chosen to purify the sample. After centrifugation, the extract was determined by the method below. The targets was separated by the gradient elution with a reverse phase column as the stationary phase and 0.1% formic acid with acetonitrile as the mobile phase. The qualification and quantification were achieved by a tandem mass spectrometry. The results showed that the LOD of the method was 2.5 μg/kg and the LOQ was 5 μg/kg. The linearity of the method was good in the range of 5～200 μg/kg and the liner correlations were all above 0.995, and the recovery of 7 targets were between 60% and 110%, and theRSDwere lower than 20%, which showed the good accuracy and precision of the method.

tylvalosin; 3-acetyl tylosin; dispersive solid phase extraction; tandem mass spectrometry

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.8.06

2017年农业行业标准制定和修订项目；上海市市级农口系统青年人才成长计划(沪农青字(2016)第2-5号)

吴剑平，硕士，畜牧师，从事兽药残留分析与研究。

李丹妮。E-mail: yure@sina.com

2017-01-13

A

1002-1280 (2017) 08-0030-10

S859.84