射干麻黄汤对急性哮喘小鼠模型IL-17A及IL-17F表达的影响

隋博文，翟平平，李明虎，李明爽，王浩，王达，彭先祝

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

射干麻黄汤对急性哮喘小鼠模型IL-17A及IL-17F表达的影响

隋博文1，翟平平2，李明虎2，李明爽2，王浩2，王达2，彭先祝1

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：探讨射干麻黄汤对急性哮喘小鼠模型肺组织及血清中IL-17A及IL-17F表达的影响，以近一步阐明其治疗哮喘的作用机制。方法：选取60只SD小鼠随机分为6组，分别为空白对照组(A组)、哮喘模型组(B组)、地塞米松对照组(F组)、射干麻黄汤高、中、低浓度组(C、D、E组)。显微镜镜下观察经HE染色的肺组织的病理性改变，哮喘小鼠血清检测IL-17A及IL-17F水平，肺组织中IL-17A mRNA及IL-17F mRNA的水平采用逆转录-聚合酶链反应法检测。结果: 小鼠肺组织中B组IL-17A mRNA及IL-17F mRNA的表达量均明显高于A组(P<0.01)。与B组比较, C、D、E组BALF中IL-17A mRNA及IL-17F mRNA水平降低(P<0.05)，且C组IL-17A mRNA及IL-17F mRNA表达量下降最为明显。C组与F组IL-17A mRNA及IL-17F mRNA表达量相接近。小鼠血清中IL-17A及IL-17F水平变化与小鼠肺组织IL-17A mRNA及IL-17F mRNA水平变化趋势基本相同。结论：射干麻黄汤可能是通过降低IL-17A及IL-17F细胞因子的分泌,来起到治疗哮喘的目的。

射干麻黄汤；哮喘小鼠模型；IL-17A；IL-17F

支气管哮喘(哮喘)的长时间反复发作可引起气道重塑，严重影响肺功能。其主要发病机制是炎症-免疫反应。当前研究认为原始Th0细胞可在过敏原的促使下，可向抗原特异性分化为Th2细胞，形成T细胞中以Th2细胞为优势的免疫应答，致使Th1/Th2比例失衡[1]。由一类Th细胞亚群CD4+IL-17可进一步促使上述定向分化，诱发以嗜酸粒细胞浸润为主哮喘发生机制的变态炎性反应[2]。哮喘炎性反应及免疫调节中发挥重要作用是主要通过分泌IL-17来完成，目前已发现IL-17具有6种分型，其中IL-17A及IL-17F对哮喘炎性反应及免疫调节有着重要影响，在哮喘的发病机制中，也具有一定的促进作用[3]。因此，通过观察射干麻黄汤对哮喘小鼠模型的肺组织及血清中IL-17A及IL-17F水平，初步对射干麻黄汤对哮喘防治的作用机制进行探讨，为哮喘的现代中医学治疗提供理论依据。

1 实验材料和方法

1.1 材料

OVA(卵蛋白)323-329肽段的MPA-OVA(Sigma公司)；氢氧化铝(天津致远化学试剂有限公司)；地塞米松(国药准字H20133353)；SnPP(Alexis，USA)；DAB显色剂、防脱载玻片、德国菜卡2135型切片机；加拿大麦克奥迪moticam3000显微数码成像系统；IL-17A、IL-17F检测ELISA试剂盒(上海美旋生物科研试剂有限公司)；香港Heal公司NW10LV型超纯水系统；中国湖南湘仪H-2050R型超速冷冻离心机；苏州BIOHIT公司Proline型微量移液器；上海SYSBERY公司DZF-6050型真空干燥箱；美国Thermo公司NANO 2000型紫外分光光度计；韩国BIONEER公司Exicycler 96型荧光定量PCR仪；2×Power Taq PCR MasterMix、Powder琼脂糖、Super M-MLV反转录酶、高纯总RNA快速提取试剂盒(BioTeke公司)；RNase固相清除剂(天恩泽公司)；50×TAE(Amresco公司)；SYBR Green(Solarbio)；其他试剂为国产分析纯，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2 射干麻黄汤的组方与制备

实验所用中药干预为射干麻黄汤，全方用量为射干6 g，麻黄9 g，款冬花6 g,细辛3 g,紫菀6 g,五味子3 g,半夏9 g,生姜9 g,大枣3枚组成。所用中药购自黑龙江中医药大学附属医院门诊药房，选用天江制剂溶解于蒸馏水，以低剂量为临床等效的比例为5∶2∶1的配制成18.720 g/mL、7.488 g/mL、3.744 g/mL的高、中、低的剂量溶液3个实验计量，并在4 ℃条件下保存并备用。

1.3 哮喘小鼠模型分组与建立

健康SPF级SD小鼠(黑龙江中医药大学实验室动物实验中心，生产许可证号：SCXK(黑)2013-005)，体质量20～24 g。60只SD小鼠随机平均分成的6组：分别为正常对照组(A组)、哮喘模型组(B组)、地塞米松对照组(F组)、射干麻黄汤高、中、低浓度组(C、D、E组)。适应性饲养7天后，以第1周末作为第0天，在第1、8天予A组正常饲养,B-F组小鼠腹腔注射OVA 100 mg和100 mg氢氧化铝诱导剂。第15天通过1%OVA激发小鼠3周连续雾化，雾化每次30 min。致敏后第15天开始每次雾化激发前30 min灌胃给药，分别给予C-E组射干麻黄汤药剂量18.720,7.488,3.744g/mL的药液1 mL/只[4]。给予A组等高浓度生理盐水1 mL/只。F组注射地塞米松的药液1 mL/只。各组予每天2次给药，连续3周。

1.4 标本的采集及检测

各组小鼠末次给药24 h后给予腹腔注射10%水合氯醛 (0.35 mL/kg)进行麻醉，在无菌操作下，打开小鼠胸腔并暴露双肺，采集右肺组织，用4%聚甲醛溶液固定、脱水、石蜡包埋切片，HE染色[5]。集肺左叶组织并迅速保存于-80℃冰箱，用于RT-PCR检测。暴露小鼠腹主动脉采血，并依据ELISA法检测哮喘小鼠动脉血中IL-17A及IL-17F含量。

1.5 逆转录-聚合酶链反应法测定IL-17A mRNA及IL-17F mRNA的表达

取保存于-80℃冰箱的小鼠左肺叶组织，利用总RNA提取试剂盒参照说明提取肺组织总RNA，经过测定各组小鼠肺组织中mRNA浓度并制作反转录RNA样本用量表，计算mRNA量。参照逆转录试剂盒说明在PCR仪操作完成得到对应的cDNA。置于-20℃保存。按照SYBR GREEN试剂盒说明进行操作。以内参照物为β-actin，按照引物序列：IL-17A上游引物：5′-TACCTCAACCGTTCCACTTCA-3′，下游引物5′-CACTTCTCAGGCTCCCTCTTC-3′。IL-17F上游引物：5′-CTGCTGCTGTTGATGTTGG-3′，下游引物5′-ACTGGAGCGGTTCTGGAA-3′。β-actin上游引物：5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC-3′，下游引物5′-GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3′。在反应条件(95℃，10 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s， 72 ℃ 30 s循环40次；4 ℃ 5 min)下，按照反应体系(cDNA模板1 μL，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，SYBR GREEN mastermix 10 μL，用ddH2O补足至20 μL)加入到ExicyclerTM 96荧光定量仪进行IL-17A mRNA及IL-17F mRNA水平。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠激发后的行为学观察

致敏和雾化吸入前6组小鼠的状态良好，且表现无差异。在致敏后，A组小鼠体质量较B组重，精神好，活动频繁，未见呼吸频率及深度改变。C-F组小鼠表现较轻微，仅有活动减慢、精神轻度萎靡但无不规则呼吸。B组小鼠出现呼吸急促、精神差，烦躁不安，反应迟钝，呼吸急促，鼻翼煽动，前肢挠鼻等症状。

2.2 小鼠肺组织病理学观察

A组支气管结构清晰,气道黏膜上皮及肌层完整,肺泡结构完整，管腔规则无炎性细胞浸润。B组支气管管壁结构破坏, 肺泡腔炎性细胞浸润且周围组织水肿伴炎性细胞浸润,细支气管管腔狭窄且管腔内黏液渗出物。C、D、E组支气管管壁完整，且C组最为明显,肺泡腔可见少量炎性细胞，却无周围组织水肿，细支气管管腔未见狭窄。

2.3 各组小鼠BALF中IL-17A mRNA及IL-17F mRNA的表达

结果显示小鼠肺组织中IL-17A mRNA及IL-17F mRNA表达量相接近。A组中小鼠肺组织中IL-17A mRNA及IL-17F mRNA的表达量明显低于B组，差异有统计学意义(P<0.01)。C、D、E组和F组的小鼠肺组织中IL-17A mRNA及IL-17F mRNA的表达量均明显低于B组，小鼠肺组织中IL-17A mRNA及IL-17F mRNA的表达量明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)，C组降低最为明显。见表1。

表1 射干麻黄汤对小鼠BALF中IL-17A mRNA及IL-17F mRNA浓度的影响

注:与正常对照组比较，*P<0.01； 与模型组比较，#P<0.05

2.4 各组小鼠血清中IL-17A及IL-17F的水平

结果显示各组小鼠IL-17A及IL-17F在血清中的蛋白浓度相接近，A组中IL-17A及IL-17F在血清中的蛋白浓度明显低于B组，差异有统计学意义(P<0.01)。C、D、E组和F组的IL-17A及IL-17F在血清中的蛋白浓度均明显低于B组，IL-17A及IL-17F在血清中的蛋白浓度明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)，C组降低最为明显。哮喘小鼠肺组织中IL-17A mRNA及IL-17F mRN与血清中IL-17A及IL-17F变化趋势基本一致。见表2。

表2 射干麻黄汤对小鼠血清中IL-17A及IL-17F浓度的影响

注:与正常对照组比较，*P<0.01； 与模型组比较，#P<0.05

3 讨论

支气管哮喘是最常见的非特异性呼吸道炎性的慢性疾病。哮喘气道的高反应性与Th1细胞/Th2细胞免疫平衡有关[1]。有些哮喘的发生机制，Th1细胞/Th2细胞免疫平衡尚不能解答。研究表明,在哮喘的发生机制中，Th17细胞和Treg细胞也具有重要作用[5-6]。IL-17是前炎性细胞因子，由Th17细胞分泌，其在中性粒细胞与T细胞之间具有桥梁作用[7]。通过刺激肺支气管组织，促进其合成释放炎性因子,进一步增进哮喘气道单核细胞与中性粒细胞的募集[2,8]。IL-17A及IL-17F属于IL-17中6成员之中。IL-17A是一种强大的促炎细胞因子，可促使肝素结合表皮生长因子的过表达，也可破坏某些组织因子的产生促进黏液分泌及基底膜细胞的增殖等病理改变加重气道重构。IL-17A可活化中性粒细胞，通过促进成纤维细胞和气道上皮细胞释放细胞因子来完成。并使中性粒细胞在气道募集与激活其活性。IL-17A还可在调节激酶，促进气道上皮细胞粘蛋白的表达,引起粘液高分泌[9]。研究发现：IL-17F在对炎性细胞高表达和募集、气道高反应性与重塑，也有着重要影响。IL-17F可直接刺激支气管上皮细胞,使其增加ICAM-1表达，并刺激IL-11分泌及表达，进而促进肺支气管组织增生及胶原蛋白沉淀，最终导致气道重塑[10]。

中医认为哮喘发作期主因内有痰饮留伏，外受邪气而诱发[11-12]。中医学哮喘的发病机理概括为“外因诱发，触动伏痰，痰随气升，气因痰阻，相互搏结于气道”[13-14]。在急性发作期冷哮患者最为多见。实验所用射干麻黄汤出自于《金匮要略》，是治疗急性发作期冷哮经典方剂。具有散寒解表，宣肺祛痰，温肺止咳，安中扶正之功。射干麻黄汤对哮喘的治疗效果显著[15]。本研究结果显示，哮喘小鼠BALF及血清中IL-17A及IL-17F水平明显上升，过量的IL-17A及IL-17F诱导炎性细胞因子的释放，导致Th1/Th2比例及Th17 /Treg细胞失衡,从而介导气道高炎症反应。上述细胞因子参与哮喘的气道炎症病变的发生，也是哮喘发病的基础因素。对于干预和调节其在体内的分泌水平，可减轻或干预哮喘疾病的发生及发展。哮喘小鼠经射干麻黄汤的高、中、低浓度干预治疗后， BALF及血清中IL-17A及IL-17F泌明显降低，气道、血管周围和肺泡间隔炎性细胞浸润明显减轻。

本实验结果表明：射干麻黄汤可能是通过降低IL-17A及IL-17F细胞因子的分泌和表达，来达到缓解哮喘气道高炎症反应的作用，来起到治疗哮喘的目的。

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The Influence of Shegan Mahuang Decoction on the Expressions of IL-17A and IL-17F in Acute Asthma Mice

SUI Bo-wen1,ZHAI Ping-ping2,LI Ming-hu2,LI Ming-shuang2,WANG Da2,PENG Xian-zhu2

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective:To investigate the influence of Shegan Mahuang Decoction on the expression of IL-17A and IL-17F in the lung tissue of acute asthma mice, and to further elaborate its mechanism of treating asthma. Methods: A total of 60 mice were randomly divided into six groups, namely the control group(group A), the asthma model group (group B), different concentration groups of Shegan Mahuang decotion (group C, group D, and group E), and Dexamethasone group(group F). The pathological changes of lung tissue were observed under microscope with HE staining method, levels of IL-17A and IL-17F were tested in serum, and the levels of IL-17A mRNA and IL-17F mRNA in lung tissue were detected by reverse transcription polymerase chain reaction. Results:The expressions of IL-17A mRNA and IL-17F mRNA in group B were significantly higher than those in group A(P<0.01). Compared to group B, they were both decreased in group C, group D, and group E(P<0.05), in which the changes in group C was most significant, closing to group F. The level changes of IL-17A and IL-17F had similar trend to the changes of IL-17A mRNA and IL-17F mRNA. Conlusion:Shegan Mahuang decoction may achieve the treating effect on asthma by reducing the production of IL-17A and IL-17F.

Shegan Mahuang decoction; Asthma mice model; IL-17A; IL-17F

2016-10-07

2017-02-15

黑龙江省自然科学基金项目(H201317)

隋博文(1979-)，男，博士，副主任医师，硕士研究生导师，主要从事中西医结合治疗呼吸系统疾病。

R285.5

A

1002-2392(2017)04-0053-04