射干与川射干的鉴别研究

邓杰华，周云峰，邓见春，李存金，黄炳泉，杨建冬

1.宜春市食品药品检验所，江西 宜春 336000；2.高安市人民医院，江西 高安 336000

射干（Belamcandae rhizome）为鸢尾科植物射干Belamcanda chinensis（L.）DC.的干燥根茎，具有清热解毒、消痰、利咽、抗癌的功效，临床主要用于咽喉肿痛、痰咳咳喘等症状［1-4］。射干临床应用广泛，在全国范围流通使用，需求量大，常有混淆品出现，其中典型的混淆品为川射干（Iridis tectori rhizoma），其为鸢尾科植物鸢尾Iris tectorumMaxim.的干燥根茎［5］，主要在重庆、四川等地使用，两者外形相似，功能相似，容易混淆［6-8］。为了有效对射干和川射干进行区分，本研究从性状、薄层色谱、次野鸢尾黄素含量及指纹图谱等方面对二者进行比较，为射干的质量控制及合理利用提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司），DAD 检测器；Waters E2695 2998 高效液相色谱仪（沃特世科技有限公司），PDA 检测器；超声波清洗器（昆山禾创仪器有限公司）；万分之一天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；十万分之一天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

1.2 材料与试剂

射干对照药材（中国食品药品检定研究院，120994-201206）、次野鸢尾黄素对照品（中国食品药品检定研究院，111557-200602）、射干苷对照品（中国食品药品检定研究院，111632-200602）；射干饮片分别收集于江西省部分县市批发企业、药店、医疗机构等（表1），经鉴定9 批为射干，6 批为混淆品川射干；甲醇、乙腈均为色谱纯（Sigma aldrich公司），磷酸为色谱纯（天津福晨化学试剂厂），纯化水（摩尔一级水），其他试剂均为分析纯。

表1 样品信息表

2 方法与结果

2.1 性状

射干饮片外表皮为黄褐色、棕褐色或黑褐色，川射干外表皮为灰黄褐色或棕色，以颜色来区分，差异并不明显，而以切面特征进行比较，可快速鉴别两者。射干饮片的切面呈淡黄色或鲜黄色，具散在筋脉小点或筋脉纹，有的可见环纹，而川射干的切面呈黄白色或黄棕色，无筋脉小点或筋脉纹。

2.2 薄层色谱［3］

参照《中国药典》2015 年版一部射干薄层色谱方法，喷以显色剂后105 ℃加热5 min，置紫外灯下（365 nm）检视，结果见图1。S1、S2、S4、S5、S7、S8、S10、S12、S14 为射干饮片，与对照药材相比，各斑点位置、颜色、及亮度等均较一致；S3*、S6*、S9*、S11*、S13*、S15*为川射干，与射干及射干对照药材相比，均多出现一个明显的黄色斑点，可较好地与射干区分。

图1 薄层色谱图

2.3 含量测定［3］

按照《中国药典》2015 年版一部射干含量测定方法。采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Diamonsil C18，250×4.6 mm×5 μm），以甲醇-0.2%磷酸溶液（53∶47）为流动相，检测波长为266 nm，外标法测定样品中次野鸢尾黄素含量。

结果表明，15 批样品中9 批次正品射干饮片次野鸢尾黄素含量为0.11%～0.16%，均值为0.14%，符合《中国药典》2015 年及2020 年版对射干中次野鸢尾黄素含量的规定（不得少于0.10%）；6 批次混淆品川射干饮片次野鸢尾黄素含量为0.08%～0.11%，均值为0.09%，其中有两批川射干达到药典标准。根据统计学分析（两个独立样本非参数检验），射干与川射干的次野鸢尾黄素含量差异有统计学意义（P<0.05）。样品与对照品的色谱图和紫外吸收扫描图见图2、图 3，15 批样品的次野鸢尾黄素含量见表2。

表2 样品含量测定结果

图2 色谱图：A.次野鸢尾黄素；B.射干；C.川射干

图3 紫外吸收扫描图：a.次野鸢尾黄素；b.射干；c.川射干

2.4 指纹图谱

2.4.1色谱条件色谱柱：Thermo C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～15 min 10%A，15～30 min 10%→20%A，30～50 min 20%→40%A，50～58 min 40%→50%A，58～80 min 50%→70%A）；流速为1.0 mL/min；检测波长为296 nm；柱温为25 ℃；进样量为10 μL。

2.4.2溶液的制备称取15 批样品粉末（过四号筛）各约1 g，分别置50 mL 容量瓶中，加70%甲醇适量，超声处理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm 滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。精密称取次野鸢尾黄素和射干苷，加70%甲醇制成1 mL 分别含次野鸢尾黄素9.57 μg、射干苷20.24 μg 的混合对照品溶液。

2.4.3方法学考察精密度实验：取一份样品（S1），以“2.4.2”方法处理制备供试品溶液，按照“2.4.1”项下色谱条件，连续进样6 针，记录色谱图；重复性实验：取编号为S1 的样品，平行制备6 份供试品溶液，依次进样，记录色谱图；取一份供试品溶液（S1），分别在0、2、6、12、24 h 进样，记录色谱图。以16 号峰（次野鸢尾黄素）保留时间和峰面积为参照，测得其余26 个色谱峰的相对保留时间的RSD 均小于1.28%，相对峰面积的RSD 均小于2.85%，表明该方法具有可行性。

2.4.4HPLC 指纹图谱指纹图谱的建立及共有峰的确定采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.130723 版”软件对9 批射干的指纹图谱（图4）进行相似度评价，S14 样品的各相应峰的峰面积响应值较大，以S14 样品的指纹图谱设置为参考谱图，时间窗宽度设置为0.1，以中位数法经过多点校正和谱峰匹配后，得到射干对照指纹图谱（图5），并标定了27 个共有指纹峰，其中11 号峰为射干苷，16 号峰为次野鸢尾黄素，射干的定量成分为次野鸢尾黄素，以16 号峰为参照峰。将对照指纹图谱的相似度值默认为1，计算9 批射干指纹图谱与对照指纹图谱的相似度。结果显示，9 批射干之间的相似度在0.971～1.000（>0.90），相似度评价结果较好。

图4 射干指纹图谱

图5 射干对照图谱

2.4.5混淆品川射干HPLC 指纹图谱的差异性比较6批川射干与射干的对照指纹图谱进行峰匹配，选取25 个共有指纹峰，其中9 号峰为射干苷，16 号峰为次野鸢尾黄素，并对6 批混淆品川射干与射干对照指纹图谱相似度进行评价。结果显示，6 批川射干之间的相似度在0.990～1.000（>0.90）之间，相似度较好，而与射干对照指纹图谱比较，相似度计算结果在0.582～0.627（<0.90）之间，相似度较差，可以看出，射干与川射干虽然有许多相同的化学成分［9-11］，但在整体上两者的化学成分还是具有一定的差异性。

图6 川射干指纹图谱

图7 川射干对照图谱

2.4.6聚类分析从15 批样品指纹图谱中选取峰面积总和占总峰面积80%以上的共有峰，确定9 个，以这9 个共有峰的峰面积为特征，得到15×9 阶原始数据矩阵，运用SPSS 23.0 分析软件对其进行聚类分析，采用Ward 法，以欧式平方距离为测度，对样品进行聚类分组（图8）。结果表明，15 批样品可分为两类，其中1、2、4、5、7、8、10、12、14 号归为一类（射干），3、6、9、11、13、15 号归为另一类（川射干），与相似度评价结果完全吻合。

图8 15批样品聚类分析图（Ward法）

3 讨论

本文结合性状鉴别、薄层色谱、含量测定和指纹图谱四个方面对射干和川射干进行了鉴别比较。射干与川射干从外观性状上看切面颜色及特征有明显区别，薄层色谱存在不一致的主斑点，可将二者鉴别开。指纹图谱能较全面的反映中药材及饮片中各种化学成分的分布情况，对不同品种进行定性分析［12-15］。本研究建立的指纹图谱评价方法，能够很好地对射干同品种、川射干同品种进行聚类，各自的相似度均较高，且射干与川射干二者的相似度较差（<0.65），分析主要是因为2 号峰、10 号峰、11 号峰（射干苷）、12 号峰、17 号峰、18 号峰、19 号峰、20 号峰峰面积差异较大，这8 个色谱峰可作为判别射干与川射干的特征峰，另结合聚类分析结果，能较好地反映射干与混淆品川射干的差异。次野鸢尾黄素含量二者总体有显著性差异，但部分川射干中含量与射干接近，能达到药典中射干饮片的规定，此项不适合作为二者的区别点。

从研究结果看，射干薄层色谱图显示的部分斑点颜色、位置与川射干均一致，指纹图谱显示二者有较多共有峰，分析主要是因为二者均来源于鸢尾科，成分有相似之处。

市售射干存在较多与川射干混用的现象，虽两味中药在性味、归经、应用上较相似，但《中国药典》一部明确规定其为两个完全不同的品种，且综合此次研究结果看，二者成分存在差异，导致其药理作用可能会有区别，临床使用中应注意区分，避免混淆使用。