四君子汤干预小鼠肾组织增龄性改变的代谢组学研究

刘璐，朱明雪，李奇玮，兰辛键，隋雨桐，梁华

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

方 剂 研 究

四君子汤干预小鼠肾组织增龄性改变的代谢组学研究

刘璐，朱明雪，李奇玮，兰辛键，隋雨桐，梁华*

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：基于代谢组学方法研究四君子汤干预12月龄雄性小鼠肾组织增龄性变化的作用机制。方法：选取自然增龄小鼠,对小鼠肾组织匀浆提取液进行检测，探讨12月龄雄性小鼠肾脏组织增龄性变化的代谢标志物及对应的代谢通路以及四君子汤的干预作用。结果：鉴别出四君子汤对5个代谢标志物(4,5-二氢乳清酸、花生四烯酸、泛酸、焦谷氨酸、二十二碳六烯酸)有明显的回调作用，并对相应5条代谢通路(嘧啶代谢、花生四烯酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成、泛酸和辅酶A的生物合成、谷胱甘肽代谢)产生影响。结论：四君子汤可以通过介入脂类代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢等多条代谢途径干预12月龄雄性小鼠增龄性改变。

四君子汤；代谢组学；增龄

中医学对于衰老有很多学说进行阐释，其中对于“气虚致衰”理论就有大量的文献记载。如早在《论语》中就提出“及其老也，血气既衰”；《素问·八正神明论》 中也提到 “血气者，人之神，不可不谨养”等。脾胃乃人后天之本，是气血生化之源。四君子汤出自《太平惠民和剂局方》，是益气健脾的代表方和基本方，由人参、白术、茯苓、甘草四味药组成，有“天下补气第一名方”之美称。该方益气健脾，调理气机，气血得以充盈，荣养全身，从而能够有效延缓衰老。本课题组前期研究发现四君子汤可以提升衰老模型小鼠体内IgA、IgG、IL-2的水平，减少IL-18、5-HT、TGF-β含量，有效改善机体免疫功能[1-2]。

代谢组学对机体组织器官的动态研究与中医学的整体观、系统观及辨证论治思维一致[3]。利用代谢组学探讨方证分子水平的生物标志物，可以为研究特定方证间的作用机制提供科学依据[4-6]。

本课题前期实验通过研究12月龄雄性小鼠与3月龄血清中的代谢标志物及四君子汤的干预作用，发现四君子汤能够改善增龄造成的氨基酸代谢紊乱[7]。本实验利用代谢组学技术，对四君子汤干预作用下12月龄雄性小鼠肾组织与3月龄雄鼠比较的内源性小分子代谢物质的变化进行研究，解析自然生长小鼠增龄过程中生物标志物、代谢通路的改变以及四君子汤的干预作用。掲示其增龄过程及四君子汤干预所致生理、病理改变的生物学基础。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

30只购自辽宁长生生物技术有限公司的SPF级ICR雄性小鼠，其中3月龄10只为青年对照组；12月龄20只随机分为两组，每组10只，分别作为四君子汤组和空白对照组，许可证号：SCXK(辽)2010-0001。饲养环境:温度(22±2)℃，湿度55%±15%，空气流通，自由摄食、饮水。

1.2 药品与试剂

四君子汤(黑龙江中医药大学国医堂)；水溶性维生素E粉末(美国sigma公司生产，韩国biosharp公司分装)；甲酸(北京迪马科技欧泰科技发展中心)；生理盐水(哈尔滨三联药业有限公司)；色谱甲醇(美国赛默飞世尔公司)；色谱乙腈(美国赛默飞世尔公司)。

1.3 仪器

电子分析天平AL204(上海梅特勒托利多仪器有限公司)；超低温冰箱(德国赛默飞世尔科技有限公司)；KDC-160HR 高速冷冻离心机(中国科大创新股份有限中佳分公司)；微量移液器(上海新汉计量器具技术研究所)；液相：Waters Acquity UPLC(美国Waters公司)；质谱：Waters LCT Premier XE TOF(美国Waters公司)；色谱柱：Acquity UPLCTMBEH C18柱(1.7 μm,2.1 mm×50 mm)(美国Waters公司)；工作站：MassLynxV4.1(美国Waters公司)。

1.4 药液制备

四君子汤：人参9 g(单煎后与其他药液混合)，白术9 g，茯苓9 g，炙甘草6 g，共33 g。加水适量，煎煮药液100 mL，浓度0.33 g/mL。每周定期煎取药液，4 ℃冰箱冷藏，使用前加温至37℃。

1.5 给药

四君子汤组：灌胃给药量为13 mL/(kg·d)。

青年对照组、12月空白对照组：生理盐水灌胃给药量为13 mL/(kg·d)。

给药时间是每日上午8:30-9:30，共给药30 d。

1.6 样品采集与制备

于给药第30天时对所有小鼠进行禁食，不禁水。第31天时采用颈椎脱位法处死，摘取肾脏，并对其进行称质量，标记后由液氮冷冻，统一转入-80℃冰箱冻存。

1.7 样本预处理

甲醇有机溶剂沉淀蛋白法：于冰浴中将肾组织剪成碎片，加10倍体积甲醇，匀浆，离心(离心条件为12 000×g、4℃、15 min)，转移所得上清液至另一离心管后于上述条件再次离心，取200 μL上清液，进行UPLC-TOF/MS分析。

1.8 样品的检测

1.8.1 超高液相色谱条件

ACQUITY UPLCTMBEH C18(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)色谱柱；流速0.4 mL/min；柱温40℃；样品仓温4℃；流动相A：0.1%甲酸-乙腈溶液；流动相B：0.1%甲酸-超纯水溶液；梯度洗脱程序：0～15 min,2%A～100%A。

1.8.2 质谱条件

正/负离子模式：电喷雾离子源(ESI)；利用Lockspray校正系统(美国Waters公司)进行在线质量校正，其中校正液为亮氨酸-脑啡肽(Leucine- Enkephalin)溶液，浓度为1 ng/mL，流速为20 μL/min；校正频率为15 s；采用全扫描方式，质量扫描范围为m/z：100～1 500。质谱条件见表1。

1.8.3 数据的处理

本实验采用Progenesis QI 2.1软件对数据进行色谱峰识别和峰匹配，利用PCA主成分分析以及OPLS-DA正效偏最小二乘-判别对12月空白对照组与3月青年对照组之间的代谢物谱差异进行分析，进而由VIP变量重要性投影和EZinfo软件筛选出生物标记物等。

表1 质谱条件

2 实验结果

2.1 仪器稳定性

本实验每隔10个待测样品，进一组质量控制样品(QC)，经PCA主成分分析证明仪器稳定性良好，实验数据可靠。

2.2 3月青年对照组与12月空白对照组的整体评价

如图1、2所示，将两组的各个散点分别置于同一椭圆形中发现，其中左侧的是3月青年对照组，右侧的是12月空白对照组，正、负离子条件下，两组小鼠明显分离，证明12月空白对照组与3月青年对照组间有明显差异。

图1 3月青年对照组与12月空白对照组雄鼠肾组织正离子条件下经OPLS-DA分析后的Scores图

图2 3月青年对照组与12月空白对照组雄鼠肾组织负离子条件下经OPLS-DA分析后的Scores图

2.3 四君子汤对正、负离子条件下12月雄性小鼠肾组织整体状态的调节作用

如图3、4所示，将三组的各个数据分别置于同一椭圆中发现，其中左侧的是四君子汤组，中间的是12月组，右侧的是3月组，三组数据间离散程度很强，证明四君子汤在正/负离子条件下，对12月雄性小鼠肾组织有一定的调节作用。

图3 四君子汤对12月雄鼠肾组织正离子条件下整体状态经PLS-DA分析后的Scores图

图4 四君子汤对12月雄鼠肾组织负离子条件下整体状态经PLS-DA分析后的Scores图

图5 12月雄鼠肾脏正离子条件下S-plot图

2.4 代谢标志物和代谢通路的筛选

通过上述方法，本实验基于VIP值>2，P值<0.05进行代谢差异物筛选。并经由QI软件处理及HMDB数据库检索筛选得出代谢差异物。如S-plot图见图5、7；VIP图见6、8。利用Metaboanalyst数据库对所得代谢差异物进行标志物筛选，共得出正离子条件下6个代谢标志物，负离子条件下16个代谢标志物，如表2所示。图9、10分别为正/负离子条件下12月雄鼠肾组织代谢标志物峰面积变化情况以及给药组与12月空白组进行T检验的结果，由图可见，四君子汤对C00219、C006429、C00337、C00864、C001879这5个代谢标志物有明显回调趋势。其所对应的5条代谢通路可由图11所示，分别为花生四烯酸代谢；不饱和脂肪酸生物合成；嘧啶代谢；泛酸和辅酶A的生物合成；谷胱甘肽代谢。

图6 12月雄鼠肾脏正离子条件下VIP图

图7 12月雄鼠肾脏负离子条件下S-plot图

图8 12月雄鼠肾脏负离子条件下VIP图

HDMBIDKEGGID物质名称离子模式趋势代谢途径HMDB01043C00219Arachidonicacid正↓花生四烯酸代谢;不饱和脂肪酸生物合成HMDB00157C00262Hypoxanthine正↓嘌呤代谢HMDB00528C003374,5-Dihydrooroticacid正↓嘧啶代谢HMDB00210C00864Pantothenicacid正↓泛酸和辅酶A的生物合成HMDB10315C030334-Hydroxyandrostenedioneglucuronide正↓戊糖、葡萄糖醛酸转换;淀粉蔗糖代谢HMDB02183C06429Docosahexaenoicacid正↓不饱和脂肪酸生物合成HMDB01248C00016FAD负↓核黄素代谢HMDB00126C00093Glycerol3-phosphate负↓甘油磷脂代谢;甘油酯代谢HMDB01043C00219Arachidonicacid负↓花生四烯酸代谢;不饱和脂肪酸生物合成HMDB00251C00245Taurine负↓牛磺酸和牛磺酸代谢;初级胆汁酸生物合成HMDB00157C00262Hypoxanthine负↓嘌呤代谢HMDB00210C00864Pantothenicacid负↑泛酸和辅酶A的生物合成HMDB00673C01595Linoleicacid负↓亚油酸代谢;不饱和脂肪酸生物合成HMDB00267C01879Pyroglutamicacid负↑谷胱甘肽代谢HMDB00253C01953Pregnenolone负↑类固醇激素的合成HMDB03598C02075Retinylester负↓视黄醇的代谢HMDB02577C03033Cholicacidglucuronide负↓戊糖、葡萄糖醛酸转换;淀粉蔗糖代谢HMDB01016C03492D-4'-Phosphopantothenate负↓泛酸和辅酶A的生物合成HMDB00363C0513817a-Hydroxypregnenolone负↑类固醇激素的合成HMDB00010C052992-Methoxyestrone负↑类固醇激素的合成HMDB02183C06429Docosahexaenoicacid负↓不饱和脂肪酸生物合成HMDB00653C18043Cholesterolsulfate负↓类固醇激素的合成

图9 正离子条件下12月雄鼠肾组织代谢标志物表达水平变化情况 注:与青年对照组相比,#P<0.05,##P<0.01;与空白对照组相比,*P<0.05,**P<0.01

图10 负离子条件下12月雄鼠肾组织代谢标志物表达水平变化情况 注:与青年对照组相比,#P<0.05,##P<0.01;与空白对照组相比,*P<0.05,**P<0.01

图11 左图为正离子条件下12月雄鼠肾组织代谢途径散点图;右图为负离子条件下12月雄鼠肾组织代谢途径散点图

3 讨论

3.1 不饱和脂肪酸生物合成

代谢标志物花生四烯酸(C00219)、二十二碳六烯酸(C06429)参与了不饱和脂肪酸生物合成。不饱和脂肪酸是人体的一种必需脂肪酸[8]，能够酯化胆固醇，刺激脂质代谢，预防心血管疾病、提高免疫力，促进生长发育，延缓衰老[9]。

3.2 花生四烯酸代谢

代谢标志物花生四烯酸(C00219)参与了花生四烯酸代谢途径。花生四烯酸(ARA或AA)是一种人体必需的多不饱和脂肪酸，游离的AA可在酶的刺激下生成众多的具有很强生物活性的二十碳衍生物，如前列腺素(PG)，前列环素(PGI2)和血栓烷素(TXA2)等[10]。AA及其代谢物能够促进脂类代谢、调节免疫和造血功能、调节免疫应激、舒张血管、促进细胞分裂，抑制肿瘤[10-11]。

3.3 嘧啶代谢

代谢标志物4,5-二氢乳清酸(C00337)参与了嘧啶代谢。嘧啶类碱基是构成核苷酸的重要组分，衍生品有胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶[12]。

3.4 泛酸和辅酶A的生物合成

代谢标志物泛酸(C00864)参与了泛酸和辅酶A的生物合成通路。泛酸又称遍多酸，是一种水溶性B族维生素，是辅酶A(CoA)和酰基载体蛋白(ACP)生物合成的前体物质，CoA可以介入机体的糖、脂肪、蛋白质和能量代谢，为生命活动提供绝大部分的能量。泛酸参与类固醇紫质、褪黑激素和亚铁血红素的合成过程，还可提高机体免疫力[13]。

3.5 谷胱甘肽代谢

代谢标志物焦谷氨酸(C01879)参与了谷胱甘肽代谢。谷胱甘肽一般指的是还原性谷胱甘肽(GSH)[14]。GSH由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成[15]，其在免疫细胞中的水平高低可调控免疫反应，其中包括Th细胞功能以及抗体的生成[16]。体内的自由基能够通过与GSH中的巯基结合，快速排出体外，进而起到保护机体的作用[17]。

4 小结

综上所述，12月龄相较于3月龄雄性小鼠肾组织间的代谢标志物有明显增龄性变化；四君子汤对其中呈下调趋势的代谢标志物C00219、C00337、C06429有上调作用，对呈上调趋势的C00864、C01879有下调作用。它们分别参与了花生四烯酸代谢、嘧啶代谢、不饱和脂肪酸代谢、泛酸和辅酶A生物合成及谷胱甘肽代谢等代谢途径。由结果可知四君子汤主要能够改善机体增龄过程中发生的氨基酸、脂类代谢紊乱，并通过影响泛酸及辅酶A生物合成关键酶类及核苷酸代谢途径从而调节能量及物质代谢，能够有效调节机体免疫和抗氧化的能力，保护细胞，维持细胞正常分解等。四君子汤为益气健脾的代表方剂[18-19]，利用代谢组学技术研究四君子汤对自然增龄动物的干预作用，为多角度，全方位认识四君子汤抗衰老机制及其对应的方证相关的生物学基础提供科学有效的理论依据。

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Intervention Effect of Sijunzi Decoction to Ageing Changes of Nephridial Tissue Based on Metabonomics

LIU Lu, ZHU Ming-xue, LI Qiwei, LAN Xin-jian,SUI Yu-tong, LIANG Hua

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To study the mechanism ageing changes of nephridial tissue in 12 months male mice by Sijunzi decoction intervention. Methods: Natural aging mice were selected in this research. The homogenate extract of nephridial tissues were tested by metabonomics. The endogenous metabolic markers and corresponding metabolic pathways were analyzed to discuss the intervention effects of Sijunzi decoction. Results:Sijunzi decoction had up-regulation effect for the five metabolic markers (4,5-Dihydroorotic acid; Arachidonic acid; Pantothenic acid; Pyroglutamic acid and Docosahexaenoic acid) to influence this five metabolic pathways(pyrimidine metabolism; AA metabolism; biosynthesis of unsaturated fatty acids; biosynthesis of pantothenic acid and CoA; glutathione metabolism). Conclusion: Sijunzi decoction may intervene the ageing changes in 12 months male mice, in terms of the metabolism of lipid, amino acid and nucleotide.

Sijunzi decoction; Metabonomics; Ageing

2017-03-22

2017-04-20

国家自然科学基金项目(81473563)

刘璐(1991-)，女，硕士研究生，专业:方剂学。

*通讯作者：梁华(1962-)，女，教授，博士研究生导师，主要从事衰老及营养代谢相关病症的方剂配伍规律研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)04-0048-05