补肾活血中药复方对AGEs条件下体外纯化培养视网膜Müller细胞活力的影响

秦伟，谢学军，李志英，杨宇琦，宋明霞，曹新伟，马殿伟，荣素然，陈一兵，王雪菁

(1.广州中医药大学附属中山医院，广东 中山 528400;2.成都中医药大学眼科四川 成都 610075;3.广州中医药大学第一附属医院眼科，广东 广州 510000)

实 验 研 究

补肾活血中药复方对AGEs条件下体外纯化培养视网膜Müller细胞活力的影响

秦伟1，谢学军2*，李志英3，杨宇琦1，宋明霞2，曹新伟2，马殿伟2，荣素然2，陈一兵1，王雪菁1

(1.广州中医药大学附属中山医院，广东 中山 528400;2.成都中医药大学眼科四川 成都 610075;3.广州中医药大学第一附属医院眼科，广东 广州 510000)

目的：探讨补肾活血中药对体外糖基化终末产物(AGEs)条件下视网膜Müller细胞活力的影响。 方法：体外纯化培养7天SD大鼠视网膜Müller细胞至P2代；中药血清药理学方法制备补肾活血中药含药血清；体外纯化培养的P2代视网膜Müller细胞置于AGEs状态下，以补肾活血中药含药血清干预，检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出量。结果：(1)低AGEs组较正常对照组LDH值有升高趋势，其差异无统计学意义(P>0.05)；高AGEs组较正常对照组LDH值明显升高，其差异有统计学意义(P<0.05)。(2)正常中药干预组与正常对照组LDH值比较，其差异无统计学意义(P>0.05)。(3)AGEs中药干预组较AGEs组LDH值明显降低，其差异有统计学意义(P<0.05)。结论：AGEs条件可导致体外纯化培养的大鼠视网膜Müller细胞细胞膜稳定性下降，通透性增加，细胞活力降低，补肾活血中药含药血清可提高AGES条件下视网膜Müller细胞活力，这可能是补肾活血中药防治糖尿病性视网膜病变(DR)的药物干预途径之一。

补肾活血；Müller细胞；糖基化终末产物；乳酸脱氢酶

糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常见的慢性微血管并发症，成人主要致盲疾病之一。DR发病机制有糖基化终末产物(advanced glycationend products，AGEs)形成堆积、细胞生长因子异常、多元醇肌醇代谢异常等，其中AGEs的形成和堆积，可导致氧化应激作用增强、血管舒缩调节功能异常、细胞外基质结构和功能异常、白细胞粘滞性增加并影响视网膜内皮细胞、周细胞、RPE细胞的生理功能，使视网膜屏障受到破坏[1]，可作为DR微血管病变的独立危险因素。目前多项实验表明视网膜Müller细胞在DR疾病过程中起重要作用，包括影响视网膜的代谢状况, 破坏视网膜精细结构，分泌多种生长因子等，并可能参与免疫细胞增殖及视网膜神经细胞损伤过程[2]。本实验组前期研究表明补肾活血中药复方[3-7]是治疗DR的一种有效方法。其作用机制是否与补肾活血中药复方对糖尿病条件下视网膜Müller细胞活力的调节有关？综上，本实验旨在研究AGEs条件下补肾活血中药复方对视网膜Müller细胞活力的影响，为临床更好的应用补肾活血中药防治DR提供一定的实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

视网膜Müller细胞纯化培养：清洁级Sprague-Dawley(SD)SD大鼠9只，新生7天，雌雄不限，成都中医药大学实验动物中心提供(川实动管质第99-11号)。

补肾活血中药复方含药血清：清洁级Sprague-Dawley(SD)SD大鼠50只，体质量约150～180 g，8～12周龄，雌雄各半，成都中医药大学实验动物中心提供(川实动管质第99-11号)。

实验试剂：糖基化终末产物(AGEs北京博奥森生物技术有限公司)；谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)鉴定 I抗兔多克隆抗体(SANTA CRUZ，美国)，II抗生物素化羊克兔抗体(SANTA CRUZ，美国)；LDH检测试剂(Bio-Rad，美国)。

1.2 中药含药血清制备

补肾活血中药复方(由人参须、丹参、地黄、葛根等组方，成都中医药大学提供)。SD大鼠50只，体质量120～150 g，随机分为补肾活血中药复方血清组、空白对照组两组，简称为中药含药血清组、空白血清组，具体方法同前期研究[8]。

1.3 视网膜Müller细胞原代及传代培养及鉴定

SD大鼠9只，新生7天，酶消化法体外纯化传代培养视网膜Müller细胞，GS免疫组化染色鉴定，实验细胞取用P2代细胞；具体方法同前期研究[8]。

图1 SD大鼠原代视网膜Müller细胞培养5 d后倒置显微镜像(×100)

图2 SD大鼠P2代视网膜Müller细胞培养5 d后谷氨酰胺合成酶(GS)染色像(×200)

1.4 实验分组

实验1组：正常对照组，DMEM培养基，含20%空白血清；实验2组：正常中药干预组，DMEM培养基，含20%中药含药血清；实验3组：低剂量AGEs组，含20%空白血清的DMEM培养基+终浓度为50 mg/L的AGEs；实验4组：低剂量AGEs中药干预组，含20%中药含药血清的DMEM培养基+终浓度为50mg/L的AGEs；实验5组：高剂量AGEs组，含20%空白血清的DMEM培养基+终浓度为100 mg/L的AGEs；实验6组：高剂量AGEs中药干预组，含20%中药含药血清的DMEM培养基+终浓度为100 mg/L的AGEs。

1.5 视网膜Müller细胞LDH漏出量的测定

将密度为2×106个/mL的P2代Müller细胞接种于48孔培养板，每孔400 μL；培养24 h，弃用含有血清的培养液，加入无血清的培养液，培养24 h，弃用无血清培养液，加入上述分组不同条件培养液，培养干预48 h；每孔收集培养基上清液50 μL，并快速加入LDH检测试剂(具体操作参照LDH试剂盒说明书)，使用490型酶标仪检测吸光度(OD)值的变化(440 nm)，计算LDH值，单位：U/L。

1.6 统计分析

实验数据用均数±标准差表示，数据分析应用SPSS17.0软件，多组间两两比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 视网膜Müller细胞鉴定结果

纯化培养原代视网膜Müller细胞，GS染色阳性率达80%以上,表现为大量棕色阳性反应位于细胞核及细胞浆内，细胞周围可见稍浅的免疫阳性反应，勾勒出的带有终足以及蹼形爪的扁平细胞轮廓，P1代与P2代细胞GS染色阳性率达85%以上。见图1、图2。

2.2 AGEs条件对体外纯化培养视网膜Müller细胞LDH漏出量的影响

见表1。低AGEs组LDH值与正常对照组比较有升高趋势，其差异无统计学意义(P>0.05)；高AGEs组LDH值较正常对照组升高，其差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 AGEs条件对视网膜Müller细胞LDH漏出量的影响

注：与正常对照组比较,▲P<0.05；与低AGEs组比较,●P<0.05

2.3 正常条件下补肾活血中药复方含药血清对体外纯化培养视网膜Müller细胞LDH漏出量的影响

见表2。正常中药干预组的的LDH值与正常对照组比较，其差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 正常条件下含药血清对视网膜Müller细胞LDH漏出量的影响

2.3 补肾活血中药复方含药血清对低剂量AGEs条件下体外纯化培养视网膜Müller细胞LDH漏出量的影响

见表3。低AGEs中药干预组LDH值较低AGEs组明显降低，其差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 低剂量AGEs条件下含药血清对视网膜Müller细胞LDH漏出量的影响

注：与低AGES组比较,▲P<0.05

2.4 补肾活血中药复方含药血清对高剂量AGEs条件下体外纯化培养视网膜Müller细胞LDH漏出量的影响

见表4。高AGEs中药干预组LDH值较高剂量AGEs组明显降低，其差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 高剂量AGEs条件下含药血清对视网膜Müller细胞LDH漏出量的影响

注：与高AGES组比较,▲P<0.05

3 讨论

DR属祖国医学“消渴目病”范畴，基本病机为气阴两虚、肝肾不足，瘀血阻络、痰浊内生及痰瘀互结，以肝肾亏虚为本，以瘀为标[9-10]。滋补精血、补益肝肾为治疗之本，活血化瘀通络之法贯穿治疗始终[11-12]。据此我们自拟补肾活血中药复方用于治疗DR。前期研究表明[3-7]它是治疗DR的一种有效方法。

视网膜Müller细胞是视网膜最重要的神经胶质细胞，它贯穿整个视网膜，自外界膜纵向向内伸展，包裹并串联起视网膜的各类神经细胞，对视网膜神经元细胞有营养支持作用，视网膜Müller细胞的突起紧紧贴附于视网膜毛细血管壁，是血-视网膜屏障重要的构成部分，这也决定了Müller细胞对维持视网膜稳定的内环境将起到至关重要的作用[13]。同时，Müller细胞的形态结构也决定了Müller细胞极易受到各种病例因素的影响。视网膜电图的b波起源于视网膜神经元和Müller细胞，有研究表明在DR早期即发现视网膜电图b波改变[14]，这就表明Müller细胞在DR的早期即发生了功能障碍。

细胞膜具有通透性，其通过选择性的控制物质进出细胞膜而控制细胞内外的物质交换，从而使细胞处于一个相对稳定的环境中。细胞膜通透性发生障碍是细胞代谢障碍的首要表现。有学者认为糖尿病患者各类并发症发生的一个重要基础病变就是细胞膜系统的异常，其是导致细胞内外环境改变的基本条件[15]。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)是一种活细胞内特异性标志酶，正常生理状态下细胞外漏出量很少，病理条件下导致细胞膜通透性发生障碍，细胞外 LDH 漏出量则大量增多，且其累计漏出量与受损细胞数量呈正相关[16]。可见，病理条件下细胞膜越不稳定，细胞外LDH漏出量越多。因此，LDH细胞外释放量就可作为一个反映视网膜Müller细胞在DR早期功能受损情况的敏感指标。本实验结果显示，低剂量AGEs组、高剂量AGEs组较正常对照组LDH值均升高，高剂量AGEs组较正常对照组，其差异有统计学意义(P<0.05)。这就表明：在AGEs条件下，体外纯化培养的大鼠视网膜Müller细胞受损，细胞膜稳定性下降，通透性增加，活性减弱。

本实验结果显示，补肾活血中药复方含药血清对正常条件下体外纯化培养视网膜Müller细胞的LDH漏出量无明显影响(P>0.05)；但能明显降低AGEs条件下视网膜Müller细胞的LDH漏出量(P<0.05)。这就提示补肾活血中药复方含药血清对正常条件下视网膜Müller细胞细胞活性无明显影响，但能明显提高AGEs条件下视网膜Müller细胞细胞膜稳定性、降低细胞膜通透性，从而减轻细胞损害，提高细胞活力。因此，笔者推测，补肾活血中药复方能提高糖尿病性视网膜病变(DR)患者视网膜Müller细胞细胞膜的稳定性，增强视网膜Müller细胞活力，这可能是补肾活血中药复方防治DR的药物干预途径之一。

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Effect of Bushen Huoxue Compound Formulae on Retinal Müller Cells Cultured in AGEs Condition

QIN Wei1, XIE Xue-jun2, LI Zhi-ying3, YNAG Yu-qi1, SONG Ming-xia2, CAO Xin-wei2,MA Dian-wei2, RONG Su-ran2, CHEN Yi-bing1, WANG Xue-jing1

(1.ZhongshanHospitalAffiliatedofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Zhongshan528400,China;2.ChengduUniversityofTCM,Chengdu610075,China;3.TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510000,China)

Objective：To investigate the effect of Bushen Huoxue formula on the activity of retinal Müller cells(RMCs) purified in vitro under AGEs conditions. Methods: The RMCs of seven-day SD rats was cultured by way of modified enzyme-digestion method. The serum was made from Bushen Huoxue formula. Purified RMCs were cultured under AGEs conditions, and the serum was added to the culture medium. After 48hrs, LDH leakage was detected. Results: 1.Compared to the normal control group, there was an increasing trend of LDH leakage in the low-dose AGEs group, but there was no significant difference between the two groups (Ρ>0.05); LDH leakage was increased significantly in the high-dose AGEs group compared to the normal control group (Ρ<0.05). 2.There was no statistical significance in terms of LDH leakage between the TCM intervention group and the normal control group (Ρ>0.05). 3.The LDH leakage of the TCM intervention group was reduced significantly compared to the AGEs group (Ρ<0.05). Conclusion: The serum made from Bushen Huoxue formula could increase the activity of RMCs under AGEs conditions, which may be its mechanism for diabetic retinopathy.

Bushen Huoxue; Müller cells; AGEs; LDH

2016-08-20

2016-09-25

国家自然科学基金资助项目(81072845)；广东省中医药管理局资助项目(20164030)；广东省中山市科技局资助项目(2016B1050)

秦伟(1979-)，男，博士研究生，副主任医师，研究方向：眼底病防治。

*通讯作者：谢学军(1963-)，女，博士，教授，博士研究生导师，研究方向：中医药防治眼底病。

R285.5

A

1002-2392(2017)04-0009-04