穿山龙降糖制剂的降糖药理作用研究

方芳，顾媛媛，郭玉岩，马艳春，王艳丽，周海纯，张丹丹，张洪财*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江护理高等专科学校，黑龙江 哈尔滨 150301；3.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

穿山龙降糖制剂的降糖药理作用研究

方芳1，顾媛媛1，郭玉岩1，马艳春1，王艳丽2，周海纯3，张丹丹1，张洪财1*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江护理高等专科学校，黑龙江 哈尔滨 150301；3.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

目的：本实验筛选穿山龙提取物降血糖有效部位，为制备穿山龙降糖制剂做基础准备。方法：应用大鼠模型，通过测定空腹血糖、糖化血红蛋白、空腹血清胰岛素等指标，确定穿山龙降血糖有效部位。结果：治疗前后各组大鼠体重呈逐渐下降趋势，正常组呈增长趋势；治疗前后正常组大鼠空腹血糖呈水平变化，穿山龙组血糖表现为下降趋势、二甲双胍组大鼠空腹血糖呈先下降后上升趋势，模型组大鼠空腹血糖呈逐渐增长趋势；治疗8周后，模型组、穿山龙组、二甲双胍组与正常组比较，均有统计学意义(P<0.01)；治疗8周后，模型组、二甲双胍组空腹血清胰岛素水平与正常组比较，穿山龙组空腹血清胰岛素水平与正常组比较，均有统计学意义(P<0.05)。结论：穿山龙降血糖有效部位具有较好的治疗效果，可制备成穿山龙降糖制剂。

穿山龙；降血糖；药理作用

糖尿病是胰岛素作用障碍或分泌缺陷引起血糖升高为特征的代谢性疾病，是危害人类生命健康的重大疾病，我国糖尿病患者人数居首位。目前，治疗方式为服用西药和改变生活方式。西药主要类型包括：二甲双胍，二肽基肽酶IV抑制药、a-葡萄糖苷酶抑制药、胰高血糖素样肽-1类似物磺脲类、PPAR-γ激动药、胰岛素等。虽然西药疗效显著，但耐用性低，毒副作用大，不适合长期服用[1-2]。如何安全、有效防治糖尿病成为世界各国学者共同关注的焦点。糖尿病在中医学属于“消渴”范畴,《金匮要略》《千金要方》《普济方》均有记载。中药治疗该病历史悠久，经验丰富，流传了很多经方。因此，研发中药(天然药物)降血糖成为热点，具有较大的开发潜力。

穿山龙(DioscoreanipponicaMak.)为薯蓣科薯蓣属植物穿龙薯蓣的根茎，又称穿地龙、穿山薯蓣、穿龙骨、穿龙薯蓣、地龙骨等。性温，味苦、甘。功效为舒筋通络、止咳平喘、活血止痛、祛风除湿[3-4]。我国主要分布于东北、浙江北部、江西等地，朝鲜、俄罗斯等国也有野生资源[5]。穿山龙主要化学成分包括延龄草皂苷、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷及水溶性皂苷，另外淀粉、甾醇、树脂、氨基酸、尿囊素、黄酮、多糖类等成分[6-12]。穿山龙的现代药理学作用主要包括：有镇痛、抗炎、降尿酸、抗疲劳、抗高脂血症、缓解更年期综合征、降糖、平喘、耐缺氧、抗肿瘤、抗氧化、保肝作用[13-16]。本项目前期实验已证实穿山龙提取物具有降血糖的药理作用，基于此，进一步筛选出穿山龙提取物降血糖有效部位，为制备穿山龙降糖制剂做基础准备。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取SPF级大鼠70只，体质量(190±5)g，雌雄各半，由本校GLP提供，实验动物生产许可证号：SCXK(黑)2013-004，实验动物使用许可证号：SYXK(黑)2013-012。

1.2 受试药品

穿山龙药材购自黑龙江中医药大学附属第一医院；穿山龙总皂苷咀嚼片，由黑龙江中医药大学药学院药物制剂实验室自制，批号：20160915；二甲双胍，中美上海施贵宝制药有限公司生产，批号：20160619。

1.3 耗材与试剂

链脲佐菌素(STZ)，北京酷莱博科技有限公司；糖化血红蛋白测定试剂盒，上海晶都生物科技有限公司；血清胰岛素测定试剂盒，武汉明德生物科技有限公司；葡萄糖液体试剂盒，上海源叶生物技术有限公司； 特异性引物，北京鼎国昌盛生物科技有限公司；乙醇等有机试剂均为分析纯，上海麦克林生化科技有限公司； Trizol M-MLV First Strand Kit，上海北诺生物科技有限公司。

1.4 仪器

AL204型电子天平，深圳市盛美仪器有限公司；UV-6100S型紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司；DNM-9602A型酶联免疫检测仪，深圳市优米仪器设备有限公司；GL-12M离心机，苏州市莱顿科学仪器有限公司；武汉盛世达医疗设备有限公司； IQTM5型荧光定量PCR仪，美国Applied Biosystems公司。

2 实验方法

2.1 模型的建立

选取SPF级大鼠70只，按体质量随机分成正常组8只和造模鼠62只，雌雄分笼饲养。造模鼠进行造模实验，正常组用普通饲料喂养，造模鼠用高脂饲料喂养。两周后，以35 mg/kg的剂量对造模大鼠一次性腹腔注射使用0.1 mol/L枸橼酸盐缓冲液配制的10 mg/mL的链脲佐菌素溶液。正常组给予同体积的枸橼酸盐缓冲液注射。72 h后测定空腹血糖，2型糖尿病模型标准为空腹血糖≥16.7 mmol/L，观察大鼠血糖值及死亡情况，隔日后对未达该标准的造模大鼠以30 mg/kg剂量的链脲佐菌素溶液一次性腹腔补充注射。1周后，随机测定血糖值≥16.7 mmol/L，为糖尿病模型建立成功。成模大鼠随机分成模型组11只，穿山龙组12只，二甲双胍组11只。

2.2 给药方法

所有模型制备成功后，正常组、模型组给予等量的饮用水，穿山龙组按0.675 g/(kg·d)给药，二甲双胍组0.1 g/kg给药，各组每天灌胃给药。连续8周。

2.3 观察指标、检测步骤

2.3.1 一般状况观察

定期观察包括动物的精神状况、体质量、尿量等。

2.3.2 空腹血糖的测定

造模72 h后，治疗4周后，各组大鼠眼眶静脉窦采血1 mL，治疗8周后大鼠断颈取血1 mL，收集血清离心后，按葡萄糖液体试剂盒测定试剂盒说明书进行操作。

2.3.3 糖化血红蛋白的测定

治疗8周后各组大鼠断颈取血2 mL，收集血清离心后，弃上清液，放入冰箱-20℃保存，按糖化血红蛋白测定试剂盒说明书进行操作。

2.3.4 空腹血清胰岛素的测定

治疗8周后各组大鼠断颈取血1 mL，收集血清离心，放入冰箱-20℃保存备用，采用ELISA法检测。按大鼠Insulin定量试剂盒操作。

2.4 统计学分析

釆用SPSS16.0软件分析，组间使用t检验，以P<0.05及P<0.01具有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况比较

治疗4周，模型组与正常组比较，穿山龙组与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，穿山龙组与二甲双胍组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，治疗8周，二甲双胍组、穿山龙组与各自治疗4周的自身前后对照中，差异均有统计学意义(P<0.01)，穿山龙组与模型组比较，差异也有统计学意义(P<0.01)，穿山龙组与二甲双胍组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

表1 各组大鼠治疗前后体质量比较±s,g)

3.2 空腹血糖动态变化比较

表2 各组大鼠治疗前后空腹血糖比较±s,mmol/L)

治疗前后正常组血糖呈水平变化，穿山龙组血糖呈下降趋势、二甲双胍组大鼠空腹血糖呈先下降后上升趋势，模型组大鼠空腹血糖呈逐渐增长趋势。治疗前模型组、穿山龙组、二甲双胍组较正常组，差异均有统计学意义(P<0.01)。模型组、穿山龙组、二甲双胍组之间两两比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗4周，穿山龙组与正常组、模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。治疗8周，穿山龙组与治疗4周的自身前后对照比较、与正常组、模型组、二甲双胍组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。与正常组、模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

3.3 糖化血红蛋白比较

治疗8周后，模型组、穿山龙组、二甲双胍组与正常组比较，有显著性差异(P<0.01)。与二甲双胍组比较，穿山龙组能降低糖化血红蛋白，并有统计学意义(P<0.01)(见表3)。

表3 各组大鼠治疗8周后糖化血红蛋白比较±s)

3.4 空腹血清胰岛素比较

治疗8周后，模型组、二甲双胍组空腹血清胰岛素水平与正常组比较，穿山龙组空腹血清胰岛素水平与正常组比较，均有统计学意义(P<0.05)。穿山龙组空腹血清胰岛素水平与模型组比较，二甲双胍组空腹血清胰岛素水平与模型组比较，也均有统计学意义(P<0.05)。与二甲双胍组比较，穿山龙组能增加空腹血清胰岛素水平(P<0.01)(见表4)。

表4 各组大鼠治疗8周后空腹血清胰岛素比较±s,ng/mL)

4 讨论

糖尿病特征为并发症多，病程较长，并且机理复杂。目前无理想的治疗药物。中医药在治疗该病过程中发挥着多功效、多途径、多靶点的优势。本实验以检测空腹血糖、糖化血红蛋白、空腹血清胰岛素指标，确定了穿山龙降血糖有效部位。(1)对糖尿病大鼠体质量的影响[17],治疗8周，较模型组，穿山龙组、二甲双胍组均能减轻糖尿病大鼠体质量的下降。(2)对糖尿病大鼠空腹血糖的影响[18]，治疗8周，穿山龙组较自身治疗周、较二甲双胍组均能持续降低血糖，并有统计学意义；从分子生物学角度，穿山龙片能维持降糖作用可能与穿山龙片较二甲双胍中药能持续保护胰岛β细胞功能、能增加受体后信号转导通路等多勒点作用有关。(3)对糖尿病大鼠糖化血红蛋白的影响[19-20]，穿山龙组、二甲双胍组较模型组均能明显降低糖化血红蛋白，有显著性差异，表明穿山龙片、二甲双胍组中药均能有效长期的降低血糖；穿山龙片组较二甲双胍组中药能有效降低大鼠糖化血红蛋白，表明穿山龙片长期降糖作用较二甲双胍组中药作用更强，这可能与穿山龙片降糖效果显著有关，也可能与穿山龙片中化学成分能抑制蛋白非酶糖化过程以减少糖基化产物形成等作用有关。(4)对糖尿病大鼠空腹血清胰岛素的影响[21]，穿山龙组较模型组均能升高空腹血清胰岛素水平，穿山龙组较二甲双胍组中药也能升高空腹血清胰岛素水平，有显著性差异。这可能与穿山龙组较二甲双胍组中药更能抑制免疫反应、保护细胞、改善胰岛素受体后抵抗等作用有关。

本课题组对穿山龙有效部位降糖机制进行了初探，观察骨骼肌GLUT4、CAP mRNA相对表达，结果显示两者的扩增、溶解曲线，均有特异性扩增。表明其降糖作用机制之一是GLUT4、CAP mRNA的表达增加。对穿山龙有效部位降糖机制、作用靶点还需进一步深入研究。下一步将对其降糖有效部位进行物质基础研究，通过柱色谱、分析型(制备型)HPLC、NMR、MS等方法系统化学成分研究，鉴定(表征)化学成分的结构，对成分进行体内、外降糖活性筛选确定有效成分(群)。阐明其降糖药效物质及提供先导化合物。随着科技的进步，应用新技术(新方法)寻找治疗效果显著、作用缓和、毒副作用小的单体化合物。为进一步开发降糖新制剂提供理论基础。

[1] 糟玉琴,张颖.近代中医药治疗糖尿病的现状及进展[J].世界最新医学信息文摘,2016,16(26):43-44.

[2] 栗明，丁常宏，方芳.糖尿病中医治疗进展[J].中医药信息，2012，29(6):112-115.

[3] 杜虹韦.穿龙薯蓣与盾叶薯蓣研究开发概况[J].中医药学报，2010,38(3):131-134.

[4] 赵旭,周艳丽,代丽娟.薯蓣皂苷对IBS-D模型大鼠治疗作用研究[J].中医药学报,2017,45(2):22-24.

[5] 张数鑫,周录英,于元杰.穿龙薯蓣研究进展[J].分子植物育种,2005,3(1):107-111.

[6] 康利平，马百平，王煜,等.穿山龙中举体皂苷的分离鉴定[J].中国药学杂志,2005,40(20):1539-1542.

[7] 张家勇.穿龙薯蓣水溶性成分的研究[D].沈阳:沈阳药科大学,2007.

[8] 卢丹,工春宇,刘金平.穿龙薯蓣地上部分的化学成分[J].中草药,2007,38(12):1785-1787.

[9] 陈帅,卢丹,赵岩.穿龙薯祯地上部分脂溶性成分的GC-MS分析[J].特产研究,2007(3):50-51.

[10] 王昭晶,罗巅辉.穿山龙多糖的提取、纯化与抗氧化活性研究[J].天然产物研究与开发,2007，19(1):29-34.

[11] 刘克建,张天,邓冬莉.穿山龙化学成分与分离纯化技术研究进展[J].广州化工,2013,41(11):21-23.

[12] 宋艺君,郭涛,王昌利.穿山龙总皂苷大孔吸附树脂纯化工艺研究[J].中医药信息,2015,32(1):3-6.

[13] 张宁,于栋华,周琦,等.穿山龙药理作用的研究进展[J].中国药房,2015,26(4):547-550.

[14] 李德成,刘庆燕,刘春燕.穿山龙的化学成分和药理作用研究进展[J].山西中医学院学报,2016,17(2):69-70.

[15] 姚丽,刘树民.中药穿山龙新的药理作用及其有效部位的实验研究[J].中华中医药学刊,2010,28(9):1979-1981.

[16] 薛剑,朱瑞琪,卢芳,等.穿山龙总皂苷对痛风性关节炎大鼠肝脏组织β半乳糖苷酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖酶活性的影响[J].中医药学报,2014,42(4):47-49.

[17] 吴伟.降糖三黄片对糖尿病大鼠骨骼肌GLUT4的转位通路研究及循证研究[D].广州：广州中医药大学,2014.

[18] 洪雨.2型糖尿病病程与中医证候的相关性研究[D].北京：北京中医药大学,2013.

[19] Ameriesn Diabetes Association. Executive summary:Standards of medical care in diabetes -2010[J].Diabetes Care,2010,33(Suppl 1):S4-10.

[20] 张冬青,汪德清.糖化血红蛋白与糖尿病并发症的相关性研究[J].军医进修学院学报,2009,30(4):467-468.

[21] 曹石金,何朝辉,李逊.糖尿病大鼠模型的制备[J].解剖学研究,20I2,34(4):295-298.

Pharmacological Study of Rhizoma Dioscoreae Nipponicae Action of Lowering Blood Sugar

FANG Fang1, GU Yuan-yuan1, GUO Yu-yan1, MA Yan-chun1, WANG Yan-li2,ZHOU Hai-chun3, ZHANG Dan-dan1, ZHANG Hong-cai1

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.HeilongjiangNursingCollege,Harbin150301,China; 3.TheSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150001,China)

Objective: This research screened the effective part for lowering blood sugar fromRhizomaDioscoreaeNipponicaeextract, laying a foundation for anti-diabetes medicinal extracted fromRhizomaDioscoreaeNipponicae. Methods: The effective part for lowering blood sugar fromRhizomaDioscoreaeNipponicaewas determined by testing fasting blood glucose(FBG), HbA1c, serum fasting insulins(FINs) in diabetes rats. Results: Before and after treatment, the body weight of each group gradually decreased, it showed a trend of growth in the normal group; the fasting blood glucose of the normal group showed no obvious change, FBG was gradually increased in the model group, it showed a decreasing trend in theRhizomaDioscoreaeNipponicaegroup, whereas it showed a decreasing trend first following an increasing trend in the Metformin group; After eight weeks of treatment, there was a significant difference in terms of FINs between the normal group and the other groups (P<0.05). Conclusion: The effective part ofRhizomaDioscoreaeNipponicaehas a good therapeutic blood-lowering effect and it can be prepared into a patterned preparation.

RhizomaDioscoreaeNipponicae; Lowering blood sugar; Pharmacological effects

2016-10-08

2016-11-04

哈尔滨市科学技术局科技创新人才应用技术研究与开发(青年后备人才)项目(2016RQQXJ125)；黑龙江省博士后资助经费(LBH-Z16193)；黑龙江中医药大学校科研基金资助项目(201210)

方芳(1980-)，女，博士，助理研究员，从事中医药研究工作。

*通讯作者：张洪财(1983-)，男，博士研究生，助理研究员，研究方向：中药有效成分的活性研究及先导化合物的发现。

R285.5

A

1002-2392(2017)04-0033-04