固相萃取/高效液相色谱-串联质谱法测定黄瓜及土壤中的春雷霉素残留

戚 燕，贾曼婷，石梦琪，李 辉，王珊珊，金 芬，佘永新，金茂俊，邵 华，郑鹭飞，王 静

(中国农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所/农业部农产品质量安全重点实验室，北京 100081)

研究简报

固相萃取/高效液相色谱-串联质谱法测定黄瓜及土壤中的春雷霉素残留

戚 燕，贾曼婷，石梦琪，李 辉，王珊珊*，金 芬，佘永新，金茂俊，邵 华，郑鹭飞，王 静*

(中国农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所/农业部农产品质量安全重点实验室，北京 100081)

建立了测定黄瓜和土壤中春雷霉素残留的固相萃取/高效液相色谱-串联质谱(SPE/HPLC-MS/MS)方法。黄瓜和土壤样品分别经1%甲酸的甲醇、0.5%甲酸水提取后，采用MCX固相萃取柱净化，以Waters Xbridge BEH Amide色谱柱分离，0.2%甲酸水-乙腈溶液进行梯度洗脱，电喷雾正离子(ESI+)模式电离，多反应监测(MRM)模式检测，基质匹配标准曲线外标法定量。该方法灵敏、准确、简单快速、重复性好，在2～250 μg/L浓度范围内，不同基质中春雷霉素的线性相关系数均大于0.999，检出限为0.002 mg/kg，定量下限为0.008 mg/kg；在0.008、0.040、0.200、0.400 mg/kg 4个加标水平下，春雷霉素在黄瓜和土壤样品中的平均回收率为77.5%～97.0%，相对标准偏差为2.6%～10.7%，能够满足黄瓜及土壤中春雷霉素残留的检测需求。应用该法对田间样品进行检测，结果表明，春雷霉素在黄瓜中的残留量不超过 0.053 mg/kg，小于我国规定的黄瓜中最大残留限量(0.2 mg/kg)；土壤中春雷霉素的残留量不超过0.013 mg/kg。

春雷霉素；黄瓜；土壤；高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)；固相萃取

春雷霉素(Kasugamycin)，化学名为(5-氨基-2-甲基-6-(2，3，4，5，6-羟基环己基氧代)四氢吡喃-3-基)氨基-α-亚氨醋酸(结构式见图1),可通过干扰致病菌细胞内部与氨基酸代谢相关的酯酶系统，影响蛋白质的合成，从而抑制菌丝伸长和细胞颗粒化，对蔬菜、瓜果和水稻等作物的多种细菌和真菌性病害具有较为理想的防治作用[1]。由于其对人、畜、家禽及水生生物的毒性均较低，符合现代环保要求，被农业部列为无公害农产品生产推荐农药[2]，具有广阔的应用前景。随着人们对农药残留引起的农产品质量安全问题的日益关注，我国、日本、美国等国家均针对不同作物中的春雷霉素制定了最大残留限量(MRL)标准(0.04～0.2 mg/kg)，包括蔬菜、水果、谷类等农作物[3-5]，其中我国和日本规定黄瓜中春雷霉素的临时限量值为0.2 mg/kg。

图1 春雷霉素的结构式 Fig.1 Structural formula of kasugamycin

春雷霉素的检测方法包括高效毛细管电泳[6-7]、反相高效液相色谱法[8]、离子对色谱法[6,9-10]、亲水作用色谱-串联质谱法[11-14]等。其中，高效毛细管电泳技术操作较为不便；反相高效液相色谱法由于春雷霉素的极性大，在色谱柱上保留时间较短，不利于春雷霉素与杂质分离，灵敏度和准确度较低；离子对色谱法通过加入十二烷基硫酸钠等试剂改善了春雷霉素的分离效果，但对实验操作条件要求较高，且加入的离子对试剂可能会污染色谱柱及仪器；现有的亲水作用色谱-串联质谱法虽然灵敏度较高，但前处理多需同时使用HLB和SCX两种固相萃取柱净化样品，操作复杂，不利于大批量样品的处理。目前虽然水、土壤、农药制剂等样品中春雷霉素的分析方法[8,12,15]已有报道，但其在食品中的残留分析方法相对较少，在黄瓜样品中的残留分析方法尚未见报道。

本研究以黄瓜及土壤为对象，采用固相萃取柱净化样品，通过优化提取溶剂、固相萃取吸附剂以及固相萃取条件等因素，结合高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)技术，建立了SPE/HPLC-MS/MS测定黄瓜和土壤中春雷霉素残留的分析方法，并利用该方法研究了春雷霉素在黄瓜和土壤中的残留状况。该方法简单、快速、灵敏，能够满足现有农药残留最大限量标准需求，相关研究可为春雷霉素的科学使用以及食品中春雷霉素的残留分析和风险评估提供重要依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200 液相色谱仪(美国 Agilent 公司)，API2000 串联四极杆质谱仪(美国 ABSciex公司)，IKA-2 高速匀浆机(德国 IKA 公司)，高速离心机(美国 Thermo 公司)，涡流混合器(海门市其林贝尔仪器有限公司)，万分之一电子天平(瑞士 Mettler Toledo 公司)。

春雷霉素(Kasugamycin)标准品(纯度99%，德国 Dr.E 公司)；乙腈、甲醇(色谱纯，Mreda公司)；6 mL(150 mg) Oasis MCX固相萃取柱(美国Waters 公司)。

1.2 仪器条件

1.2.1 高效液相色谱条件 Waters Xbridge BEH Amide色谱柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)；流动相为0.2%甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱程序：0～2 min，20%～50% A，2～7 min，50% A，7～7.1 min，50%～20% A，7.1～12 min，20% A；流速0.2 mL/min；柱温28 ℃；进样量5 μL。

1.2.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；喷雾电压(IS+)：5 500 V；电喷雾离子源温度(TEM)：450 ℃；雾化气流量：50 psi；辅助加热气：344.7 kPa；气帘气：275.8 kPa；碰撞室入口电压(EP)：10 V；碰撞室出口电压(CXP)：4 V；定性离子对：m/z383.3/200.3，383.3/156.1；定量离子对：m/z383.3/112.1。

1.3 前处理方法

1.3.1 黄瓜及土壤样品的提取 称取匀浆后的黄瓜样品5.0 g，加入10 mL 1%甲酸的甲醇溶液高速匀浆1 min，剧烈晃动2 min后，8 000 r/min离心5 min，吸取上清液。黄瓜残渣再加入 10 mL 1%甲酸的甲醇溶液，高速匀浆1 min，剧烈晃动2 min后，8 000 r/min离心5 min，吸取上清液。合并两次上清液，以1%甲酸的甲醇定容至25 mL。

称取土壤样品5.0 g，加入10 mL 0.5%甲酸水溶液高速匀浆1 min，剧烈晃动2 min后以8 000 r/min离心5 min，吸取上清液。土壤残渣再加入10 mL 0.5%甲酸水溶液高速匀浆1 min，剧烈晃动2 min后以8 000 r/min离心5 min，吸取上清液。合并两次上清液，以0.5%甲酸水溶液定容至20 mL。

1.3.2 净 化 分别移取5 mL黄瓜、土壤提取液加至已依次用5 mL甲醇和5 mL水活化的MCX固相萃取柱中，待样液流尽后依次用5 mL水和5 mL甲醇淋洗固相萃取柱，真空抽至近干，再加入5 mL 2% 氨化甲醇溶液进行洗脱，收集洗脱液于10 mL离心管中，氮气下吹干后用2 mL甲醇-水(1∶1，体积比)复溶，涡旋后过 0.22 μm有机滤膜，滤液供HPLC-MS/MS检测。

1.4 标准溶液配制及标准曲线的绘制

称取春雷霉素标准品约0.01 g(精确至0.000 1 g)，用甲醇溶解后定容于100 mL容量瓶中，得1.0×105μg/L的标准储备液，-20 ℃保存。移取适量的标准储备液用乙腈稀释成约10 mg/L 的混合标准中间液。分别用纯溶剂和空白基质提取液配制春雷霉素质量浓度分别为2、5、10、25、125、250 μg/L的系列溶剂标准工作溶液和基质匹配标准工作溶液，按“1.2”条件进行测定，重复3 次。以进样浓度为横坐标，对应峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

考察了甲醇以及含不同甲酸含量的甲醇溶液对黄瓜样品中春雷霉素提取效果的影响(图2A)，结果表明，以1%甲酸的甲醇溶液提取2次可获得较为满意的回收率。对于土壤样品，实验最初尝试以甲酸含量为0～1.5% 的甲醇溶液作为提取液，但提取效果均较差，故考察了水以及不同甲酸含量的水溶液的提取效果(图2B)。结果表明：以0.5%甲酸水溶液或1%甲酸水溶液提取2次时，提取效果均较好，但以1%甲酸水溶液为提取液时，春雷霉素在固相萃取小柱上的保留能力较差，导致回收率偏低。因此，最终确定以1%甲酸的甲醇溶液和0.5%甲酸水溶液分别作为黄瓜和土壤样品的提取液，且各提取2次。

QuEChERS方法快速简单，但其去除干扰物质的能力比SPE柱略差[16]。样品净化过程中首先尝试采用QuEChERS方法，发现PSA、GCB 和 C18对样品的净化效果均较差，与溶剂标准工作溶液相比，相同进样条件下同样浓度的基质匹配标准工作溶液的响应值下降了1/2，故采用固相萃取的方法净化样品。实验考察了HLB、SCX及MCX 3种固相萃取柱对黄瓜和土壤的净化效果。结果显示，MCX柱的回收率显著优于HLB柱及SCX柱，这是由于MCX柱属于混合阳离子交换柱，具有反相和强阳离子交换保留双重能力，对弱碱性的春雷霉素具有更好的保留能力。进一步考察了2%、5%、10%氨化甲醇溶液以及洗脱体积对春雷霉素洗脱效果的影响。为避免杂质干扰，综合考虑回收率及处理效率，最终选择5 mL 5%的氨化甲醇溶液为洗脱液。

2.2 色谱条件的优化

图3 黄瓜(A)及土壤(B)空白样品中添加0.200 mg/kg春雷霉素后的色谱图 Fig.3 Chromatograms of blank cucumber(A ) and soil (B) samples spiked with 0.200 mg/kg kasugamycin

春雷霉素是强极性化合物，在C18色谱柱上保留较弱，使用离子对试剂虽然可以提高其保留能力，但灵敏度较差，因此本实验考虑采用对极性化合物保留作用较强的亲水相互作用色谱柱。比较了XBridge BEH Amide、XBridge BEH HILIC、Atlantis Hilic Silica(150 mm×2.1 mm，3.5 μm) 3种色谱柱的分离效果，结果发现在相同色谱条件下，春雷霉素在XBridge BEH Amide色谱柱上保留能力较好。进一步考察了乙腈-0.2%甲酸水体系中不同流动相比例对春雷霉素色谱峰峰形的影响。结果表明，当采用乙腈比例为80%或70%的流动相进行等度洗脱时，色谱峰峰形较差；当以“1.2.1”所述条件进行梯度洗脱时，春雷霉素的色谱峰峰形对称尖锐，且与杂质的分离较好。故最终采用XBridge BEH Amide色谱柱进行梯度洗脱分离。

2.3 工作曲线与检出限

基质效应较大会影响分析方法的灵敏度和准确性，给分析结果带来误差[17-18]。分别将空白样品提取液和溶剂配制的浓度为2～250 μg/L 的标准溶液，在相同HPLC-MS/MS条件下进行分析。春雷霉素的溶剂、黄瓜基质和土壤基质标准曲线分别为y=40.1x+76.8(r=0.999 9)、y=60.5x+ 385(r=0.999 5)、y=45.4x+15.1(r=0.999 6)。将春雷霉素标准溶液稀释至3倍信噪比(S/N=3)，以此进样浓度为检出限(LOD)，以S/N=10对应的加标水平为定量下限(LOQ)，得到春雷霉素在黄瓜和土壤基质中的LOD为0.002 mg/kg，LOQ为0.008 mg/kg。

2.4 准确度与精密度

采用空白黄瓜和土壤样品，分别添加4个水平(0.008、0.040、0.200、0.400 mg/kg)的春雷霉素标准溶液，按照前述方法进行提取净化，每个加标水平重复测定5个样品，典型的黄瓜和土壤添加回收谱图见图3。黄瓜中春雷霉素的平均回收率为77.5%～97.0%，相对标准偏差(RSD)为2.6%～4.6%；土壤中春雷霉素的平均回收率为79.1%～86.6%，RSD为7.2%～10.7%(表1)。结果表明本方法具有较好的准确度及精密度，可满足春雷霉素残留的分析要求。

表1 春雷霉素在黄瓜和土壤中的加标回收率及相对标准偏差(n=5)

表2 黄瓜与土壤中春雷霉素的最终残留量

*the residues of kasugamycin were lower than LOQs

2.5 实际样品的测定

为了验证方法的可靠性和实用性，运用本方法对黄瓜和土壤田间实际样品进行测定。田间试验于2015～2016年在湖北省武汉市、山东省济阳县、海南省海口市三地进行，供试药剂为30%春雷霉素·壬菌铜微乳剂，按照低剂量(春雷霉素33 g a.i/ha)、高剂量(春雷霉素49.5 g a.i/ha)各施药3次、4次，施药间隔7 d，末次施药后间隔3、5、7 d采集样品进行田间处理，结果如表2所示。可以看出，黄瓜和土壤样品中春雷霉素的最终残留量随采收间隔时间的延长而呈递减趋势，春雷霉素的残留量均小于我国规定的黄瓜中最大残留限量(0.2 mg/kg)。

3 结 论

本研究通过优化样品提取和净化方法，建立了固相萃取/高效液相色谱-串联质谱(SPE/HPLC-MS/MS)测定黄瓜和土壤中春雷霉素残留的分析方法。相对于传统检测方法，该法简化了前处理步骤，采用亲水相互作用色谱柱进行柱色谱分离，有效降低了样品基质的干扰，提高了分析的灵敏度和准确度。方法检出限为0.002 mg/kg，在0.008～0.400 mg/kg添加水平下，春雷霉素在黄瓜和土壤中的平均回收率为77.5%～97.0%，RSD为2.6%～10.7%。该方法线性范围宽、回收率高、精密度好，灵敏、准确、简单、快速，能满足黄瓜中春雷霉素残留的监测及该药的残留登记试验需求。

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Determination of Kasugamycin Residues in Cucumber and Soil by Solid Phase Extraction/High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

QI Yan,JIA Man-ting,SHI Meng-qi,LI Hui,WANG Shan-shan*,JIN Fen,SHE Yong-xin,JIN Mao-jun,SHAO Hua,ZHENG Lu-fei,WANG Jing*

(Institute of Quality Stanard and Testing Technology for Agro-products,Chinese Academy of Agricultural Sciences/Ke Laboratory of Agro-products Quality and Safety of Chinese Ministry of Agriculture,Beijing 100081,China)

A sensitive solid phase extraction/high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(SPE/HPLC-MS/MS) method was developed for the determination of kasugamycin residues in cucumber and soil.The cucumber and soil samples were extracted with 1% formic acid methanol solution and 0.5% formic acid water solution,respectively,and cleaned up with MCX solid phase extraction column,then separated on a Waters Xbridge BEH Amide column using acetonitrile-0.2% formic acid as mobile phase by gradient elution.The qualitative and quantitative analyses were performed under positive electrospray ionization(ESI+) in multiple reaction monitoring(MRM) mode,with the matrix-matched calibrations.The calibration curves showed good linearities in the concentration range of 2-250 μg/L with correlation coefficients more than 0.999.The limits of detection(LOD) and the limits of quantitation(LOQs) were 0.002 mg/kg and 0.008 mg/kg,respectively.The average recoveries at four spiked levels(0.008,0.040,0.200,0.400 mg/kg) were in the range of 77.5%-97.0% for cucumber and soil,with relative standard deviations(RSDs) of 2.6%-10.7%.The method is simple,rapid,sensitive,accurate and reproducible,and could meet the requirements for analysis of kasugamycin residues in cucumber and soil samples.The method was applied in the detection of the field samples,and the contents of kasugamycin residues in cucumber and soil were found not more than 0.053 mg/kg and 0.013 mg/kg,respectively,which were below the maximum residue limits(MRL) for kasugamycin in cucumbers defined by China(0.2 mg/kg).

kasugamycin;cucumber;soil;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);solid phase extraction(SPE)

2017-04-07；

2017-04-25

中国农业科学院科技创新工程“农业化学污染物残留检测及行为研究”创新团队资助

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.08.008

O657.63;F767.2

A

1004-4957(2017)08-0992-06

*通讯作者：王珊珊，博士，助理研究员，研究方向：农药残留检测究，Tel：010-82106569,E-mail：sunnynomadtea@163.com 王 静，博士，教授，研究方向：农产品质量与安全，Tel：010-82106568，E-mail：w_ jing2001@126.com