甲酯化方法对番茄、哈密瓜、葡萄和石榴四种籽油脂肪酸组成分析的影响

2015-03-24武鹏凯林宏英黄建梅王春梅

特产研究 2015年2期

武鹏凯，林宏英，黄建梅，王春梅

(北京中医药大学中药学院，北京 100102)

油脂及脂肪酸(特别是12碳以上的长碳链脂肪酸)沸点高、高温下不稳定、易裂解，一般不直接进行气相色谱分析，将它们与甲醇反应，制备成脂肪酸甲酯，降低沸点，提高稳定性，然后进行气相色谱分析[1]。甲酯化方法对油脂及脂肪酸组成分析结果影响较大，选择一种快速的、合适的甲酯化方法至关重要。脂肪酸甲酯化的方法可分为酸催化法和碱催化法二大类[2]。酸催化法中常用的是HCl-甲醇溶液法[3]、H2SO4-甲醇溶液法[4]、BF3-甲醇溶液法[5]；碱催化法常用的是甲醇钠溶液法[6]和KOH-甲醇溶液法[7]。

番茄、哈密瓜、葡萄和石榴4种水果在我国新疆有较大的种植面积。番茄在新疆年产量已达百万吨，主要用于番茄酱的生产并出口海外[8]；葡萄产量也达百万吨[9]，主要用于葡萄酒的生产；石榴的产量达万吨[10]，主要用于制作果汁；哈密瓜产量达百万吨[11]，用于制作瓜脯、瓜汁。因此，它们的籽油作为副产品具有较大的开发潜力。为了确定适合上述4种籽油脂肪酸测定的甲酯化方法，本实验选取KOH-甲醇溶液法、H2SO4-甲醇溶液法、KOH-甲醇溶液与H2SO4-甲醇溶液法相结合3种方法[2]，分别对番茄、哈密瓜、葡萄和石榴4种籽油进行甲酯化，并通过GC-MS来分析比较3种甲酯化方法对4种籽油的脂肪酸组成分析结果的影响。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

番茄、石榴、哈密瓜、葡萄4种籽油(玛纳斯恒泰实业有限公司)；甲醇溶液(色谱纯)、正己烷(色谱纯)、无水硫酸钠(分析纯)、KOH(分析纯)、H2SO4(分析纯)(Sigma公司)。

1mol/L KOH-甲醇溶液：称取5.6g KOH置于100mL烧杯中，用甲醇溶液慢慢溶解后，转移至100mL容量瓶中，再加甲醇溶液于容量瓶至刻度，摇匀；将其浑浊液用快速滤纸过滤，澄清即可。

5% H2SO4-甲醇溶液：用移液管取5mL H2SO4置于100mL容量瓶中，再将甲醇溶液加至容量瓶刻度，摇匀。

1.2 仪器与设备

SHA-B水浴恒温振荡器(江苏金坛市华立实验仪器厂)；6850/5975 GC/MSD(美国安捷伦公司)；电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；XMTD-6000型水浴锅温控仪(绍兴市亿纳实验仪器制造有限公司)。

1.3 方法

1.3.1GC-MS实验条件气相色谱条件：HP-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；柱温：100℃升至230℃(10℃/min)，保持10min，230℃升至280℃(5℃/min)，保持5min；汽化室温度300℃；进样量0.2μL；载气He；载气流量1mL/min；分流比50∶1；溶剂延迟3min。

质谱条件：EI离子源；离子源温度230℃；电子能量70eV；发射电流34.6μA；电子倍增器电压1624V；质量范围30amu～500amu。

1.3.2KOH-甲醇溶液法[12]取100mg油样置于10mL具塞试管中，加入1mL 1mol/L KOH-甲醇溶液，在40℃下振荡30min，静置15min，加入2mL正己烷，静置10min，取上清液，加入少许无水硫酸钠。

1.3.3H2SO4-甲醇溶液法[12]取100mg油样置于10mL具塞试管中，加入2mL 5% H2SO4-甲醇溶液，在70℃下振荡60min，加入2mL正己烷，静置10min，取上清液，加入少许无水硫酸钠。

1.3.4酸碱结合法[12]取100mg油样置于10mL具塞试管中，加入1mL 1mol/L KOH-甲醇溶液，在40℃水浴中反复振摇30min，静置15min，置入70℃水浴中将其蒸干，加入2mL 5% H2SO4-甲醇溶液，在70℃水浴中振摇60min，加入2mL正己烷，静置10min，取上清液，加入少许无水硫酸钠。

1.3.5分析鉴定利用GC-MS分析，通过化学工作站G1701BA的数据处理系统，利用Nist98标准质谱库检索鉴定成分，按面积归一化法进行定量分析，测得其相对百分含量及脂肪酸组成。

2 结果与分析

2.1 3种甲酯化方法对番茄籽油脂肪酸组成分析的影响

番茄籽油脂肪酸离子流程图如图1所示，3种甲酯化方法对番茄籽油脂肪酸的鉴定结果见表1。

A.KOH-甲醇溶液法；B.H2SO4-甲醇溶液法；C.酸碱结合法。

表1番茄籽油中脂肪酸的鉴定结果

Table 1 The Identification results of tomato seed oil fatty acids

续表1

序号No保留时间Retentiontime方法1Method1方法2Method2方法3Method3化合物Compound相对含量(%)Relativecontent方法1Method1方法2Method2方法3Method3分子式Formula相似度(%)Thedegreeofsimilarity6 13.83 13.79 13.77 顺式-9,12-十八碳二烯酸(Z,Z)-9,12-Octadecadienoicacid58.41 62.51 58.15 C18H32O2 93 7 13.90 13.86 13.82 顺式-9-十八碳烯酸(油酸)Z-9-Octadecenoicacid26.31 20.80 26.78 C18H34O2 94 814.1714.1614.03十八酸(硬脂酸) Octadecanoicacid5.024.784.66C18H36O2919 14.97 14.98 14.60 反式-9,12-十八碳二烯酸(E,E)-9,12-Octadecadienoicacid0.18 0.21 0.17 C18H32O2 92 10 - - 15.60 顺式-10-十八碳烯酸Z-10-Octadecenoicacid- - 0.24 C18H34O2 80 1117.3117.3317.47二十酸(花生酸) Eicosanoidsacid0.320.270.40C20H40O2901222.80-22.86二十二烷酸 Behenateacid0.54-0.44C22H44O2871328.46-28.40二十四酸 Tetracosanoicacid0.17-0.17C24H48O281

注：方法1.KOH-甲醇溶液法；方法2.H2SO4-甲醇溶液法；方法3.酸碱结合法；-.未检出。下表同。

Note:Method 1.KOH-methanol solution method;Method 2.H2SO4-methanol solution method;Method 3.Acid-alkali combination method;-.not detected.The same in tables below.

由表1可知，采用方法1可鉴定出12种脂肪酸，检测不出顺式-10-十八碳烯酸；采用方法2可鉴定出8种脂肪酸，检测不出顺式-7-十六碳烯酸、十七酸、顺式-10-十八碳烯酸、二十二烷酸、二十四酸；采用方法3可鉴定出11种脂肪酸，检测不出顺式-7-十六碳烯酸和十七酸。

2.2 3种甲酯化方法对哈密瓜籽油脂肪酸组成分析的影响

哈密瓜籽油脂肪酸离子流程图如图2所示，3种甲酯化方法对番茄籽油脂肪酸的鉴定结果见表2。

A.KOH-甲醇溶液法；B.H2SO4-甲醇溶液法；C.酸碱结合法。

表2哈密瓜籽油中脂肪酸的鉴定结果

Table 2 The Identification results of Hami melon seed oil fatty acids

续表2

序号No保留时间Retentiontime方法1Method1方法2Method2方法3Method3化合物Compound相对含量(%)Relativecontent方法1Method1方法2Method2方法3Method3分子式Formula相似度(%)Thedegreeofsimilarity7 13.89 13.87 13.88 顺式-9-十八碳烯酸(油酸)Z-9-Octadecenoicacid25.51 21.32 22.01 C18H34O294814.1714.1614.06十八酸(硬脂酸) Octadecanoicacid5.154.797.62C18H36O2919 - - 14.10 顺式-13,16-十八碳二烯酸(Z,Z)-13,16-Octadecadienoicacid- - 0.33 C18H32O28510 14.98 - 14.59 反式-9,12-十八碳二烯酸(E,E)-9,12-Octadecadienoicacid0.11 - 0.16 C18H32O2 94 11 - - 15.09 顺式-9,12,15-十八碳三烯酸(Z,Z,Z)-9,12,15-Octadecatrienoicacid- - 0.14 C18H30O2 88 12 - - 15.20 顺式-11,14,17-二十碳三烯酸(Z,Z,Z)-11,14,17-Eicosatrienoicacid- - 0.14 C20H34O2 86 1317.3317.3317.46二十酸(花生酸) Eicosanoidsacid0.280.200.35C20H40O2881422.8422.85二十二烷酸 Behenateacid0.36-0.42C22H44O28615-26.75二十四烷酸 Tetracosanoicacid--0.11C24H48O283

由表2可知，采用方法1可鉴定出11种脂肪酸，检测不出顺式-13,16-十八碳二烯酸、顺式-9,12,15-十八碳三烯酸、顺式-11,14,17-二十碳三烯酸、二十四烷酸；采用方法2可鉴定出8种脂肪酸，检测不出顺式-7-十六碳烯酸、顺式-13,16-十八碳二烯酸、反式-9,12-十八碳二烯酸、顺式-9,12,15-十八碳三烯酸、顺式-11,14,17-二十碳三烯酸、二十二烷酸、二十四烷酸；采用方法3可鉴定出全部15种脂肪酸。

2.3 3种甲酯化方法对葡萄籽油脂肪酸组成分析的影响

葡萄籽油脂肪酸离子流程图如图3所示，3种甲酯化方法对番茄籽油脂肪酸的鉴定结果见表3。

A.KOH-甲醇溶液法；B.H2SO4-甲醇溶液法；C.酸碱结合法。

表3

葡萄籽油中脂肪酸的鉴定结果

Table3

The Identification results of grape seed oil fatty acids

续表3

序号No保留时间Retentiontime方法1Method1方法2Method2方法3Method3化合物Compound相对含量(%)Relativecontent方法1Method1方法2Method2方法3Method3分子式Formula相似度(%)Thedegreeofsimilarity6 13.83 13.82 13.87 顺式-9,12-十八碳二烯酸(Z,Z)-9,12-Octadecadienoicacid64.99 68.64 64.20 C18H32O2 94 7 13.89 13.89 13.93 顺-9-十八碳烯酸(油酸)Z-9-Octadecenoicacid19.48 16.36 20.96 C18H34O2 94 814.1714.1814.18十八酸(硬脂酸) Octadecanoicacid4.573.914.09C18H36O2929 14.98 - 14.99 反式-9,12-十八碳二烯酸(E,E)-9,12-Octadecadienoicacid0.14 - 0.11 C18H32O2 90 10 - - 16.49 顺-9,12,15-十八碳三烯酸(Z,Z,Z)-9,12,15-Octadecatrienoicacid- - 0.06 C18H30O2 88 11 - - 16.55 顺-6,9,12-十八碳三烯酸(Z,Z,Z)-6,9,12-Octadecatrienoicacid- - 0.05 C18H30O2 80 1216.82-16.8211-二十碳烯酸 11-Eicosenoicacid0.17-0.14C20H38O2821317.33-17.33二十酸(花生酸) Eicosanoidsacid0.30-0.22C20H40O2901422.86-22.84二十二烷酸 Behenateacid0.27-0.22C22H44O287

由表3可知，采用方法1可鉴定出12种脂肪酸，检测不出顺-9,12,15-十八碳三烯酸、顺-6,9,12-十八碳三烯酸；采用方法2可鉴定出6种脂肪酸，检测不出顺-7-十六碳烯酸、十七烷酸、反式-9,12-十八碳二烯酸、顺-9,12,15-十八碳三烯酸、顺-6,9,12-十八碳三烯酸、11-二十碳烯酸、二十酸(花生酸)、二十二烷酸；采用方法3可鉴定出全部14种脂肪酸。

2.4 3种甲酯化方法对石榴籽油脂肪酸组成分析的影响

石榴籽油脂肪酸离子流程图如图4所示，3种甲酯化方法对番茄籽油脂肪酸的鉴定结果见表4。

A.KOH-甲醇溶液法；B.H2SO4-甲醇溶液法；C.酸碱结合法。

表4石榴籽油中脂肪酸的鉴定结果

Table 4 The Identification results of pomegranate seed oil fatty acids

续表4

序号No保留时间Retentiontime方法1Method1方法2Method2方法3Method3化合物Compound相对含量(%)Relativecontent方法1Method1方法2Method2方法3Method3分子式Formula相似度(%)Thedegreeofsimilarity7 13.91 13.86 13.88 顺-9-十八碳烯酸(油酸)Z-9-Octadecenoicacid29.39 21.45 26.71 C18H34O2 94 814.1814.1614.13十八酸(硬脂酸) Octadecanoicacid4.663.593.92C18H36O2929 15.00 - 14.86 反式-9,12-十八碳二烯酸(E,E)-9,12-Octadecadienoicacid0.10 - 0.08 C18H32O2 90 1016.83--11-二十碳烯酸 11-Eicosenoicacid0.16--C20H38O2821117.35-17.46二十酸(花生酸) Eicosanoidsacid0.27-0.27C20H40O2901222.87-22.84二十二烷酸 Behenateacid0.44-0.33C22H44O28713--28.46二十四烷酸 Tetracosanoicacid--0.14C24H48O280

由表4可知，采用方法1可鉴定出12种脂肪酸，检测不出二十四烷酸；采用方法2可鉴定出5种脂肪酸，检测不出顺-9-十六碳烯酸、顺-7-十六碳烯酸、十七烷酸、反式-9,12-十八碳二烯酸、11-二十碳烯酸、二十酸(花生酸)、二十二烷酸、二十四烷酸；采用方法3可鉴定出11种脂肪酸，检测不出顺-7-十六碳烯酸和11-二十碳烯酸。

3 讨论与结论

将3种不同酯化方法得到的番茄籽油、哈密瓜籽油、葡萄籽油、石榴籽油的脂肪酸的数量列于表5。

表5不同甲酯化方法检测出脂肪酸的数量

Table 5 The number of fatty acids in different methylesterification method

由表5可以看出，不同甲酯化方法检测出的脂肪酸种类从多到少依次为：番茄籽油：KOH-甲醇溶液法>酸碱结合法>H2SO4-甲醇液法；哈密瓜籽油：酸碱结合法>KOH-甲醇溶液法>H2SO4-甲醇液法；葡萄籽油：酸碱结合法>KOH-甲醇溶液法>H2SO4-甲醇液法；石榴籽油：KOH-甲醇溶液法>酸碱结合法>H2SO4-甲醇液法。虽然脂肪酸种类数量的检出还与仪器的检出限及样品的浓度等有关，但同一种籽油经不同方法甲酯化后，所检测出的脂肪酸的碳原子数都在C14到C24之间，这与文献[13～19]报道是相一致的，故在仪器的检出限及样品的浓度等因素不变的情况下，认为表5的数据是具有一定参考价值的。

对番茄籽油的甲酯化方法只有KOH-甲醇溶液法的报道[13]，报道共检测出11种脂肪酸，主要为亚油酸(49.27%)、油酸(25.85%)。这与本实验采用KOH-甲醇溶液法甲酯化检测出12种脂肪酸，主要为亚油酸(58.59%)、油酸(26.31%)大致相同，但其未检测出十四烷酸，这可能是由于样品产地、生长环境、测定条件不同等因素导致的。

对哈密瓜籽油的脂肪酸组成分析有KOH-甲醇溶液法[14]和KOH-甲醇溶液与BF3-甲醇溶液法相结合的方法[15]。前者共检测出6种脂肪酸，主要为油酸(58.48%)、亚油酸(18.36%)；本实验采用KOH-甲醇溶液法甲酯化检测出11种脂肪酸，主要为亚油酸(58.63%)、油酸(26.51%)。这种差别可能与样品产地、生长环境等不同有关。文献[15]采用KOH-甲醇溶液与BF3-甲醇溶液法相结合的方法检测出13种脂肪酸，主要为亚油酸(66.80%)、油酸(17.45%)，这与本实验采用KOH-甲醇溶液与H2SO4-甲醇溶液法相结合的甲酯化方法检测出15种脂肪酸，主要为亚油酸(54.58%)、油酸(22.01%)的结果大致相同。因此，KOH-甲醇溶液与H2SO4-甲醇溶液法相结合的甲酯化方法对于哈密瓜籽油脂肪酸含量测定更合适。

对葡萄籽油的甲酯化方法只有KOH-甲醇溶液法的报道[16]，报道共检测出26种脂肪酸，主要为亚油酸(79.89%)、棕榈酸(15.17%)，这与本实验采用KOH-甲醇溶液法甲酯化所检测出的12种脂肪酸，主要为亚油酸(64.31%)、油酸(20.96%)及采用酸碱结合法检测出的14种脂肪酸是有很大差异的，这可能是样品来源不同造成的。

对石榴籽油的甲酯化方法有KOH-甲醇溶液法的报道[17～19]，报道检测出9种脂肪酸，主要成分为石榴酸(58.68%、58.68%、81.62%)；这与本实验采用KOH-甲醇溶液法甲酯化所检测出的12种脂肪酸，主要为亚油酸(56.38%)是有很大差异的，这可能为石榴籽的来源不同所导致。

从表5可以看出，KOH-甲醇溶液法和酸碱结合法检测出的脂肪酸种类显著大于H2SO4-甲醇溶液法。由文献[2，20]可知原因如下：(1)对于结合态脂肪酸，先由酸或碱催化水解生成游离脂肪酸，再与甲醇发生甲酯化反应(酯的酸性水解是可逆反应，碱性水解是不可逆反应；酯化反应时酸起催化作用，碱不起作用)；(2)对于游离脂肪酸，直接与甲醇发生甲酯化反应(酯化反应时酸起催化作用，碱不起作用)。因此，在结合态脂肪酸水解为游离态脂肪酸时，采用碱催化是更有利的；在游离脂肪酸甲酯化时，采用酸催化是更有利的。此外推测，如果先用碱甲酯化，使结合态脂肪酸水解为游离态脂肪酸；再用酸甲酯化，使所有游离态脂肪酸发生酯化反应会有更好地效果。即采用酸碱结合法甲酯化油脂，其分析效果会更好，这个推测与文献[12，21，22]所得出的数据是较为吻合的。因此，在进行未知油的脂肪酸成分分析时，选用酸碱结合法甲酯化或许是比较理想的。

新疆产番茄、哈密瓜、葡萄和石榴4种籽油中含有54%～65%的亚油酸和20%～30%的油酸，营养均衡合理，具有较大的开发利用价值。适合番茄籽油和石榴籽油甲酯化的方法为KOH-甲醇溶液法，适合葡萄籽油和哈密瓜籽油甲酯化的方法是KOH-甲醇溶液与H2SO4-甲醇溶液相结合法。

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