超高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱法测定猪粪便中6种抗生素残留的基质效应研究

周悦榕，李丹妮，吴剑平，严 凤，潘 娟，张 婧，顾 欣

(上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103)

超高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱法测定猪粪便中6种抗生素残留的基质效应研究

周悦榕，李丹妮，吴剑平，严 凤，潘 娟，张 婧，顾 欣*

(上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103)

基质效应普遍存在于液质联用分析中。该文通过评价“离子抑制率”指标，系统考察了应用超高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱法(UPLC-ESI-MS/MS)测定猪粪便中二甲氧苄啶、磺胺对甲氧嘧啶、恩诺沙星、环丙沙星、金霉素、泰乐菌素6种抗生素残留的基质效应。样品经McIlvaine-Na2EDTA缓冲溶液提取后，采用HLB固相萃取柱净化，浓缩富集后用0.1%甲酸-甲醇溶液(85∶15，体积比)溶解。经SB C18RRHD色谱柱分离，以甲醇-0.1%甲酸为流动相进行梯度洗脱，在正离子电喷雾下采用多反应监测模式检测。结果表明，猪粪便基质对6种抗生素的测定存在基质增强效应。采用基质匹配标准曲线校正法并优化样品处理条件可以对基质效应产生的影响进行补偿与消除。该研究为提高检测结果的准确度与精密度提供了借鉴。

基质效应；离子抑制率；超高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)；抗生素；猪粪便

20世纪90年代初，抗生素被广泛应用于畜禽养殖业[1-2]，主要用于动物疾病预防与治疗，作为饲料添加剂提高饲料利用率及作为动物的促生长剂等[3-5]。抗生素类药物进入动物消化道后，仅少部分经过羟基化、裂解和葡萄糖苷酸化等代谢反应成为无活性的物质，大部分抗生素(约60%～90%)以原形或代谢物形式经畜禽粪、尿和有机肥等排入农田、土壤、大气、河流湖泊、地下水等环境媒介中，最终通过食物链危及人类健康[1-15]。本实验室曾建立了一种通过采集活体动物粪便测定兽药残留的液相色谱-质谱联用检测技术[16]。该方法具有较好的准确度和精密度，能实时监控养殖环节兽药使用情况，同时通过活体样本采集的方式确保了动物本身的安全。

液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)通过确定质量的母离子匹配相应特征质量的子离子进行目标物检测，以其良好的特异性与高灵敏度著称。基质效应(Matrix effects)是LC-MS/MS分析时存在的一个非常显著的现象，会对目标化合物的准确定量产生极大影响，从而受到检测者的高度重视[17-19]。美国食品药品监督局(FDA)发布的《生物分析方法确证指南》(2001)[20]、欧洲医药评价署(EMEA)发布的《生物分析方法的验证指南原则》(2011)[21]均明确指出，采用液相色谱-质谱联用技术(LC-MSn)对生物样品中目标化合物进行检测方法的开发和方法学验证时，需要做基质效应考察。

本研究对实验室原有检测方法进行改良，利用超高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)技术建立了同时测定猪粪便中二甲氧苄啶、磺胺对甲氧嘧啶、恩诺沙星、环丙沙星、金霉素、泰乐菌素6种抗生素残留的分析方法，系统地评价了整个定量线性范围内猪粪便样品基质对6种抗生素测定的基质效应，并提出了针对性的消除方法，进一步提高了UPLC-ESI-MS/MS法测定猪粪便中6种抗生素残留结果的准确度和精密度。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters XevoTMTQ MS超高效液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾(ESI+)离子源(美国Waters公司)；MassLynx v4.1质谱工作站(美国Waters公司)；PL202-L感量为0.01 g、AB135-S感量为0.000 01 g电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；AllegraTMX-22R Centrifuge高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司)；MS3 B S25旋涡混匀器、KS-260旋涡振荡器(德国IKA公司)；Sk7210HP 超声波清洗器(上海科导公司)； Millipore A10超纯水系统(密理博(上海)贸易有限公司)；3 mL/40 mg Waters Oasis®HLB Extraction Cartridge固相萃取柱(美国Waters公司)； VisiprepTM-DL 型固相萃取装置(美国Supelco公司)；N-EVAP112 氮吹仪(美国Orangaomation公司)；亲水PTFE 0.22 μm针式滤器(上海安谱科学仪器有限公司)。

盐酸二甲氧苄啶(纯度>99%)购自中国食品药品检定研究院；恩诺沙星(纯度>99.8%)购自中国兽医药品监察所；环丙沙星(纯度>99.9%)购自Sigma公司；金霉素(纯度>92%)、泰乐菌素(纯度>98%)、磺胺对甲氧嘧啶(纯度>99%)均购自Dr.Ehrenstorfer公司；甲酸(色谱纯，美国Tedia公司)；甲醇、乙腈、氨水、醋酸、氢氧化钠、硝酸镁、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸钠(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)；柠檬酸(分析纯，上海化学试剂有限公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国Merck公司)；实验用水为超纯水；高纯氮、高纯氩(99.999%，上海佳杰特种气体公司)。

标准储备液：分别精密称取6种抗生素药物标准品0.01 g(精确至0.000 01 g)，用适量甲醇溶解并定容至10 mL，配制成质量浓度各为1 mg/mL的标准储备液，置于4 ℃冷藏保存，有效期6个月。

提取液溶液：McIlvaine-Na2EDTA(pH 4.0)缓冲液的配制：准确称取27.55 g Na2HPO4、37.22 g Na2EDTA和12.9 g柠檬酸，用1 000 mL二级水定容，配制成含0.1 mol/L Na2EDTA的McIlvaine缓冲液。用1 mol/L氢氧化钠溶液调至pH 4.0，现配现用。

淋洗液：5%甲醇水溶液的配制：准确量取5 mL甲醇并加入95 mL二级水，充分混合。

定容液：0.1%甲酸甲醇水溶液(85∶15，体积比，下同)：准确量取15 mL甲醇，加入85 mL 0.1%甲酸水溶液，充分混合。

0.1%甲酸水溶液：准确量取1 mL色谱纯甲酸，加入999 mL 一级水，充分混合。

1.2 样品采集及前处理

1.2.1 样品的采集 将采集的新鲜粪便样品，-20 ℃冷冻干燥并储存。

1.2.2 提 取 称取猪粪便样品1 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中，加入10 mL Na2EDTA-McIlvaine(pH 4.0)缓冲液，充分振荡10 min，8 000 r/min离心10 min，取出全部提取液。重复上述操作，合并2次上清液，充分混匀并准确吸取4.0 mL提取液，在4 ℃下10 000 r/min 离心10 min后待用。

1.2.3 净 化 HLB固相萃取小柱(3 mL/40 mg)先用3 mL甲醇、3 mL水活化。取4 mL离心备用液过柱，依次用 3 mL 5%甲醇溶液淋洗，3 mL甲醇洗脱。收集洗脱液于40 ℃水浴下用氮气吹至近干，用1.0 mL 0.1%甲酸-甲醇水溶液(85∶15)溶解残渣，溶液过0.22 μm滤膜后上机测定。若样品液中含有的抗生素浓度超出仪器线性范围，进样前可用0.1%甲酸甲醇水溶液(85∶15)稀释至合适浓度。

1.3 仪器条件[16]

1.3.1 液相色谱条件 色谱柱：Agilent SB C18RRHD(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；流动相：A为甲醇，B为0.1%甲酸溶液；梯度洗脱程序：0～2.0 min，20.0%～25.0% A；2.0～3.0 min，25.0%A；3.0～6.0 min，25.0%～80.0%A；6.0～7.0 min，80.0%A；7.0～7.1 min，80.0%～20.0%A；流速：0.3 mL/min。

1.3.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源；电离模式：正离子模式(ESI+)；检测方式：多反应监测(MRM)；电离电压：3.5 kV；锥孔温度：500 ℃；脱溶剂气流：800 L/h；反吹气(氮气)：50 L/h；定性离子对、定量离子对及对应锥孔电压和碰撞能量见表1。

表1 6种抗生素的定性、定量离子及锥孔电压、碰撞能量

*quantitative ion pair

1.4 基质效应的评价方法

基质匹配标准曲线与混合标准系列溶液标准曲线的配制：分别精密量取6种抗生素标准储备液，用适量甲醇稀释成质量浓度为100 mg/L的标准品混合中间液。准确称取1 g(精确至0.01 g)空白粪便，按“1.2”处理，即得空白粪便基质液。向空白粪便基质液中加入适量的混合标准中间液，配制成质量浓度分别为1、5、20、50、100 μg/L的基质匹配标准系列溶液。同时，用0.1%甲酸-甲醇水溶液(85∶15)稀释标准品混合中间液配制成质量浓度范围相同的混合标准系列溶液。在“1.3”仪器条件下，供液相色谱-电喷雾电离-串联质谱仪测定，以质量浓度(X，μg/L)为横坐标，以定量离子对相应的色谱峰面积(Y)为纵坐标，分别绘制6种抗生素的基质匹配标准曲线和混合标准系列溶液标准曲线，两种标准曲线的标准品均现配现用，并获得基质匹配标准曲线的斜率K2与混合标准系列溶液标准曲线的斜率K1，计算基质匹配标准中监控离子响应强度比试剂标准中相应监控离子响应强度减少的百分比[22]，以评价粪便样品对目标化合物的基质效应。

2 结果与讨论

2.1 基质效应的评价

液相色谱-串联质谱技术因具有高分离性能、高选择性与灵敏度、高准确度与精密度、高分析速度与检测通量等优势被广泛应用于生物样品中痕量物质的分析与检测。但采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱法进行目标化合物的痕量分析时，从色谱柱上共洗脱的非挥发性生物样品基质组分与目标化合物离子在带电液滴表面离子化的过程中相互竞争，影响电喷雾接口处目标化合物的离子化效率进而导致基质效应，并表现为“离子增强”或“离子抑制”作用，从而对定量分析方法的准确度和精密度产生影响[23-28]。其中，电喷雾离子源(Electrospray ionization ,ESI)受基质效应的干扰尤为显著。

引起基质效应的物质来源主要为生物样品中的内源性成分(如：离子颗粒物成分、强极性化合物、各种有机物、目标化合物的同类物及其代谢产物等)和样品前处理过程中引入的外源性成分(如：塑料管中残留的聚合物、固相萃取柱填料、离子对试剂、有机酸、缓冲溶液、流动相、色谱柱固定相流失物等)[27-28]。本研究的供试样品“猪粪便”是一种成分复杂的生物样品基质。从畜禽养殖场采集得到的粪便中水分占3/4，其余为固体成分(固体中30%为死细菌，10%～20%为脂肪，2%～3%为蛋白质，10%～20%为无机盐，30%为未消化的残存食物和消化液中的固体成分)[6]。因此，粪便中的这些内源性物质与样品前处理过程中引入的各类外源性物质所导致的基质效应将导致检测结果出现偏差。故本实验采用“离子抑制率[22,29-33](Ion suppression)”评价整个定量线性范围内样品基质对6种抗生素测定的影响。

据文献[22,29-33]报道，离子抑制率计算公式为Ion suppression=(K2-K1)/K1，其中K2为基质匹配标准曲线的斜率，K1为纯溶剂标准曲线的斜率。当离子抑制率为0时，表示无基质效应；当离子抑制率大于0时，表示样品基质对目标化合物的测定存在基质增强作用；当离子抑制率小于0时，表示样品基质对目标化合物的测定存在基质抑制作用。通过比较6种抗生素在猪粪便基质中的离子抑制率实验结果(见表2)发现：猪粪便样品基质对这6种抗生素的测定存在明显的基质增强效应，其中对环丙沙星、恩诺沙星、金霉素、泰乐菌素测定的基质增强效应较为显著。

表2 定容液与粪便基质样品中6种抗生素的标准曲线与离子抑制率

2.2 基质效应的消除

目前，液相色谱-串联质谱法中基质效应的消除方法主要有：改善仪器条件(如：优化色谱条件和质谱条件，改用不同的离子源等)，选择合适的样品前处理方法，选择性质相近或稳定的同位素内标校正，采用空白基质匹配标准校正法、标准加入法等[22-27]。本实验采用空白基质匹配标准曲线法进行定量，并与标准品稀释校正曲线法的定量结果进行比较，结果见图1。结果表明：通过空白粪便基质液进行标准溶液的稀释，能使标准品与样品溶液在电喷雾接口处具有一致的离子化条件，采用空白基质匹配标准曲线法进行定量，能起到消除样品中基质效应的作用，确保定量结果的准确性。

同时，在日常检测工作中发现，原有方法中使用亲水性C18粉吸附提取液中悬浮粪便基质的做法存在缺陷[16,27-28]。因为吸附剂亲水性C18粉将成为一种人为引入的外源性基质成分促进基质效应的产生，并且在大批量的检测过程中难以准确把握C18粉的用量。C18粉的过量使用不仅会导致金霉素和泰乐菌素的损失，而且会造成固相萃取柱的阻塞。因此，在以确保前处理方法对目标化合物的提取效能为前提，并尽可能避免由前处理步骤引入其他的外源性基质成分而导致额外的基质效应，同时兼顾前处理方法的简便性与可操作性的条件下，本实验室对原有方法[16]进行了调整，并进行了方法学验证，实验结果表明经本研究改良的实验方法效果良好。

2.3 样品前处理方法的比较

本研究将本实验室原有方法[16]在提取时加入吸附剂改为增加提取液用量，并在完全提取后对少量过柱样液做高速冷冻离心处理，沉淀提取液中的蛋白质与悬浮杂质。本实验采用空白粪便样品加标回收率实验，比较了本实验室原有方法的样品前处理方法与改良后样品前处理方法对6种抗生素的提取效果。各目标化合物的添加量均为5倍定量下限(LOQ)，制得的空白基质加标样品按两组分别以原方法与本研究确定的“1.2”步骤进行样品预处理，“1.3”步骤进行仪器测定，每个加标水平做6个平行，用基质匹配标准曲线定量，测定结果见表3。结果表明，改良后的样品前处理方法对6种抗生素的回收率均高于原方法，提取效果更佳。增加提取液用量不仅有利于样品前处理方法对目标化合物的提取效率，同时能稀释样品中的杂质成分，起到降低基质效应的作用。

表3 两种样品前处理方法对6种抗生素提取的批内回收率与相对标准偏差(n=6)

*without information

2.4 方法有效性验证

2.4.1 基质匹配标准曲线 精密量取6种抗生素标准储备液，用适量甲醇稀释成质量浓度为100 mg/L的标准品混合中间液。分别精密量取一定体积的该标准品混合中间液，并添加到1 g(精确至0.01 g)空白粪便中，配制成10、30、50、100、200、500 μg/kg的基质加标样，按照确定的前处理步骤与仪器条件进行样品前处理与仪器测定。以质量浓度为横坐标(X)，定量离子对相应的色谱峰面积为纵坐标(Y)，绘制基质匹配标准曲线，结果见表4。结果表明：二甲氧苄啶、磺胺对甲氧嘧啶、泰乐菌素在10～500 μg/kg、环丙沙星和恩诺沙星在30～500 μg/kg、金霉素在50～ 500 μg/kg质量浓度范围内线性良好。

2.4.2 检出限与定量下限 文献[34]采用高效毛细管电泳的方法检测畜禽粪便中氟喹诺酮类与四环素类的兽药残留，实验结果表明：该方法对恩诺沙星与金霉素的定量下限均为0.098 mg/kg。本研究取空白粪便样品做加标回收实验，按“1.2”确定的实验步骤操作，取信噪比S/N≥3为检出限(LOD)，S/N≥10为定量下限(LOQ)，结果见表4。结果表明：经本研究改良方法具有较低的检出限和定量下限，优于现有报道，检测灵敏度高，能满足对粪便样品中痕量抗生素物质的检测需求。

表4 6种抗生素的基质匹配标准曲线方程、相关系数、检出限及定量下限

2.4.3 准确度与精密度 选择猪粪便空白样品作为供试对象，以定量下限(LOQ)的1倍、5倍、10倍 3个加标水平进行空白基质加标回收率实验，考察方法的准确度与精密度。制得的空白基质加标样品按照“1.2”与“1.3”条件进行样品前处理与仪器测定，每个批次内同一加标水平平行6次，重复3批次，用基质匹配标准曲线定量，测定结果见表5。结果表明，在3个加标水平下，猪粪便中二甲氧苄啶、磺胺对甲氧嘧啶、泰乐菌素的回收率为66.3%～105.1%，恩诺沙星和环丙沙星的回收率为71.0%～102.6%，金霉素的回收率为84.6%～104.9%。批内相对标准偏差(RSD，n=6)为3.8%～17.1%，批间RSD(n=3)为1.7%～15.7%。表明该方法的准确度和精密度满足检测要求。

表5 猪粪便中6种抗生素的批内、批间回收率及相对标准偏差

2.4.4 实际样品检测 经本研究改良的实验方法能满足日常工作对畜禽粪便中6种抗生素残留的检测要求，结果见图2。随机抽样上海市某区养殖场的10个粪便样品，采用本方法进行测定，每份样品平行2次，实验结果取平均值，检测结果见表6。结果显示：金霉素、泰乐菌素、恩诺沙星在实际猪粪便样品中的检出率分别达到100%、50%、20%。

表6 实际样品中6种抗生素的检测结果

*N.D.:not detected ;D.:detected(the result is higher than LOD but lower than LOQ)

3 结 论

本研究通过考察“离子抑制率”，系统地评价了液相色谱-电喷雾电离-串联质谱检测模式下，猪粪便样品基质对二甲氧苄啶、磺胺对甲氧嘧啶、恩诺沙星、环丙沙星、金霉素、泰乐菌素6种抗生素的基质效应。结果表明，猪粪便基质对6种抗生素的测定存在不同程度的基质增强效应，采用基质匹配标准曲线校正法以及改良的样品前处理方法能予以有效地消除。本研究为快速检测并准确定量猪粪便中6种抗生素残留提供了参考依据。

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50项食品安全国际标准即将出台

由联合国粮农组织和世界卫生组织在1963年创建的“食品法典委员会”在日内瓦举行第四十届会议，与会成员考虑通过一系列新的国际食品标准，以保护消费者健康并促进开展公平的食品贸易。

粮农组织与世卫组织发表媒体通报称，来自120多个国家的600多名代表此次齐聚日内瓦，参加“食品法典委员会”第四十届会议，将对50项国际食品安全标准以及30多项新的工作建议进行讨论，并对现行法典的文本进行更新。

大会当天首先通过了有关“动物性食品中兽药最大残留限量”的最新标准，分别对牛肉中的伊维菌素、鸡肉等禽类食品中的拉沙洛西钠以及三文鱼中的氟苯脲残留量进行了明确设定。同时，各国代表同意对《新鲜水果和蔬菜卫生操作规范》进行修订，强调所有食品的生产、处理和准备过程都涉及各种风险，但可以通过遵循良好的农业和卫生措施来减少，以帮助控制微生物、化学和物理危害，最大限度地减少食源性疾病影响消费者或对公共卫生造成负面影响的可能性。

“食品法典委员会”还通过了有关《营养标签准则》的编辑修改，其中包括维生素D和E的营养参考值修订，并批准了有关“预防和减少大米砷污染操作规范”的拟议草案。此外，依据《2014-2019年战略计划》，食典委将对一系列新工作提案进行审议，其中包括鱼类中甲基汞最高含量、修订《最大限度减少和控制抗菌素耐药性操作规范》、食品中不经意出现的低水平化学物风险分析准则、减少精炼油及相关产品中化学污染物的操作规范，并修订《特定植物油标准》，其中将涉及核桃油、杏仁油、榛子油、阿月浑子油、亚麻籽油和鳄梨油等。

自1963年以来，在联合国粮农组织和世卫组织的推动下，《食品法典》已经成为消费者、食品生产者和加工者、各国食品管理机构和国际食品贸易的全球参照标准。

(信息来源：科技日报)

Study on Matrix Effects in Analysis of Six Antibiotics in Swine Manure by Ultra Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry

ZHOU Yue-rong,LI Dan-ni,WU Jian-ping,YAN Feng,PAN Juan,ZHANG Jing,GU Xin*

(Shanghai Animal Disease Control Centre，Shanghai 201103,China)

Matrix effects are universal phenomena in analysis of liquid chromatography-mass spectrometry.By evaluating ‘Ion suppression’,matrix effects of diaveridine,sulfameter,ciprofloxacin,enrofloxacin,chlorotetracycline and tylosin in swine manure detected by ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry(UPLC-ESI-MS/MS)were systematically investigated.The sample was extracted with McIlvaine-Na2EDTA buffer solution,purified and concentrated by a HLB Extraction Cartridge.The residue was dissolved by 0.1% formic acid-methanol(85∶15，by volume).The target compounds were separated on an SB C18RRHD chromatographic column with 0.1% formic acid-methanol as mobile phase by gradient elution and detected in multiple reaction monitoring(MRM) mode via positive electrospray ionization(ESI+).The result showed that matrix enhancement effects existed in the detection of six antibiotics in swine manure.Furthermore,matrix-matched calibration curve and modified sample treatment could be used to compensate or eliminate the matrix effects in analysis of six antibiotics in swine manure.The study provided a reference for improving the accuracy and precision of the detection result.

matrix effects;ion suppression;ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry(UPLC-ESI-MS/MS);antibiotics;swine manure

2017-04-11；

2017-05-10

上海市科技兴农重点攻关项目 [沪农科攻字(2011)第4-9号]资助

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.08.011

O657.63；R978.1

A

1004-4957(2017)08-1010-08

*通讯作者：顾 欣，硕士，农业技术推广研究员，研究方向：兽药饲料与畜产品质量安全检测，Tel：021-62689722，E-mail:guxun@sh163.net