川芎嗪联合来氟米特对胶原诱导关节炎大鼠血小板活化和炎症反应的影响❋

白菁安，边艳琴，牛旭艳，樊丹平，吕 诚，姜 淼，赵 宁△

(1. 中国中医科学院中医临床基础医学研究所,北京 100700； 2. 上海中医药大学附属曙光医院,上海 201203)

【实验研究】

川芎嗪联合来氟米特对胶原诱导关节炎大鼠血小板活化和炎症反应的影响❋

白菁安1，边艳琴2，牛旭艳1，樊丹平1，吕 诚1，姜 淼1，赵 宁1△

(1. 中国中医科学院中医临床基础医学研究所,北京 100700； 2. 上海中医药大学附属曙光医院,上海 201203)

目的：探讨川芎嗪联合来氟米特对胶原诱导关节炎大鼠血小板活化和炎症反应的影响。方法：将50只SD大鼠随机取10只作为正常组，其余制备大鼠关节炎模型，将成模大鼠分为模型组(CIA组)、川芎嗪组(TMP组)、来氟米特组(LEF组)、川芎嗪联合来氟米特组(T+L组)，各药物干预组分别给予相应药物，计算关节炎指数并观察关节病理变化，检测血清CRP及PDGF- BB水平，血浆GMP- 140及VCAM- 1水平。结果：与正常组比较，CIA组大鼠关节滑膜出现明显细胞增生、炎细胞浸润、血管翳形成浸入软骨， CRP及PDGF- BB水平、GMP- 140及VCAM- 1水平均显著上升；与CIA组比较，各药物干预组大鼠关节病理变化中滑膜增生、炎性细胞浸润、血管翳和骨破坏形成均有改善，大鼠关节炎指数均减小，双后肢关节红肿程度评分均降低，CRP、 PDGF- BB蛋白水平、GMP- 140水平及VCAM- 1水平均降低，其中联合用药组效果优于TMP组和LEF组。结论：川芎嗪联合来氟米特能够显著抑制胶原诱导关节炎大鼠的血小板活化和炎症反应，对于RA患者具有潜在的应用价值。

类风湿性关节炎；胶原诱导关节炎；川芎嗪联合来氟米特；血小板活化

类风湿关节炎(rheumatoid arthrits,RA) 是一种以关节滑膜慢性炎症反应、滑膜增生、血管翳形成进而侵蚀关节软骨及骨组织为基本病理改变的疾病。来氟米特是世界公认的治疗RA的常用药物[1],可以减轻RA炎症反应和对关节的破坏。但临床研究发现，对于血小板活化性高的RA患者，目前单纯应用来氟米特治疗效果并不甚满意[2]。但有研究表明，利用活血化瘀法联合来氟米特治疗类风湿关节炎，可提高来氟米特治疗效果[3]。

现代研究发现，血瘀证与血小板活化关系非常密切[4]，血小板黏附、活化、聚集进而导致血栓形成，被认为是血瘀证形成的基本病理生理基础[5]，不仅如此，血瘀证更是RA基本病机之一[6]。现代研究发现，血瘀证与炎症之间有密切联系。通过抑制血小板活化，改善血瘀证，减低炎症反应的发生，可能是很多具有活血化瘀性质中药抗炎的分子基础[7]。故本研究尝试用来氟米特联合具有降低血小板活化功能的活血化瘀药川芎嗪[8]作用于II型胶原诱导的关节炎大鼠，观察川芎嗪联合来氟米特对动物模型血小板活化的影响。

1 材料

1.1 动物

6周龄SPF级雄性SD大鼠，由军事医学科学院提供(合格证号SCXK(京)2007- 004)。

1.2 试剂

磷酸川芎嗪片购自燕京药业有限公司(批号090912)，来氟米特购自福建汇天生物药业有限公司(批号120904)，大鼠GMP- 140ELISA 试剂盒购自Elabscience公司(批号10043450)。II型胶原(批号120440)、不完全弗氏佐剂(IFA)(批号120449)购自Chondrex公司，大鼠CRP的ELISA试剂盒(批号109551062)、PDGF- BB的ELISA试剂盒(批号106627009)购自eBioscience公司。

1.3 模型制备

实验第1天取适量牛Ⅱ型胶原将其溶于0.1M乙酸，配成浓度2 mg/ml Ⅱ型胶原溶液，4 ℃过夜。此溶液再与等量不完全弗氏佐剂混合，充分乳化后以滴加于水中不扩散为度。取乳化后的混合物按200 μg Ⅱ型胶原/只大鼠于尾根部皮下免疫，1周后按100 μg Ⅱ型胶原/只于尾根部皮下加强免疫1次。正常组以等量生理盐水于尾根部进行皮下假免疫。加强免疫7 d后，至少1个足趾关节出现发红、肿胀的大鼠，即判定为造模成功。

1.4 分组及给药

将50只雄性SD大鼠按体质量分层，随机取10只作为正常组，其余40只采用牛II型胶原诱导制备大鼠关节炎模型，对成模大鼠(40只)按组织肿胀程度采用分层随机方法分为模型组(CIA组)、川芎嗪组(TMP组)、来氟米特组(LEF组)、川芎嗪+来氟米特组(T+L组)各10只，加强免疫后7 d开始给药。TMP组给予川芎嗪(25 mg/kg/d)、LEF组给予来氟米特(10 mg/kg/d)，T+L组给予川芎嗪+来氟米特药物(TMP25 mg/kg/d+LEF10 mg/kg/d),CIA组和正常组给予同等容积的蒸馏水。灌胃给药每天1次，持续4周，并每隔2 d进行1次称重。实验过程动物始终保持在12 h光照、12 h黑暗、温度20～22 ℃、湿度控制在45%～65%之间，给药期间正常供给饲料和饮水。

1.5 取材

末次给药后当天大鼠禁食不禁水，第2天称重后，3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，一部分收集于含有2%EDTA- Na2抗凝剂的抗凝管中，4 ℃ 3000rpm离心10 min，收集上层血浆置于-80℃保存备用；其余收集于离心管中，3000 rpm 4 ℃离心15 min取血清，-80℃保存、备用。取双侧后肢踝关节，剔除关节周围软组织，置于福尔马林液固定备用。

2 方法

2.1 指标检测

2.1.1 关节炎指数(Arthritis index,AI) 于给药第1、8、12、16、20、24、28天分别对各大鼠双后足关节红肿程度进行AI评分。评分方法参照5级评分法评价[9]，将2只后踝关节的病变程度累计积分，计算出关节炎指数，每个动物最大为8 分。

2.1.2 踝关节病理观察 将各组大鼠踝关节在含10%EDTA- Na2的脱钙液中脱钙，时间约持续2个月，期间每3 d更换1次脱钙液。脱钙完成后，用10%甲醛固定，然后酒精逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片，常规HE染色。

2.1.3 ELISA检测 恢复试剂盒至室温，确定所需微孔条数目及相关试剂用量。Wash Buffer(20×)稀释、Assay Buffer(20×)稀释、标准品稀释、样品稀释、标准品、待测样本、空白孔加样，1×Biotin- Conjugate配制及加样；室温孵育、洗板，1×HRP配制及加样，室温孵育及洗板；TMB底物溶液显色，Stop Solution终止显色，酶标仪检测OD值。

2.2 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠关节炎指数变化

图1显示，在给药初各组大鼠之间AI评分比较差异无统计学意义。随着造模时间的延长，从给药第8天开始，所有大鼠AI值开始出现下降趋势。与CIA组比较，在给药第12天开始，T+L组大鼠AI值开始出现显著降低(P<0.01)；在给药第16天开始，TMP、LEF和T+L组大鼠AI值均显著低于CIA组(P<0.05或P<0.01)，且一直持续至给药结束；在给药第28天时，与TMP、LEF组比较T+L组大鼠AI值显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。T+L组从给药第12天开始到给药结束，AI值均显著低于CIA组，相较LEF组下降趋势较稳定，表明川芎嗪联合来氟米特对CIA作用起效早，疗效较稳定。

图1 各组大鼠关节炎指数评分注：与CIA组比较:*P<0.05，**P<0.01

3.2 各组大鼠关节病理变化

图2显示，正常组大鼠关节结构完整，未见滑膜增生及血管翳形成，关节面平整光滑；与正常组比较，CIA组大鼠滑膜细胞大量增生，滑膜增厚，大量炎性细胞浸润，血管翳大量形成并向软骨内侵袭，关节融合成片，关节结构被破坏，关节腔明显变窄；与CIA组比较，TMP组、LEF组和T+L组大鼠关节滑膜增生、炎性细胞浸润和血管翳形成均有改善，骨破坏明显减轻，尤以T+L组作用更显著。

图2 各组大鼠关节病理变化(HE染色 ×100)注：A:正常组；B:CIA组；C：TMP组；D：LEF组；E:T+L组

组别鼠数CRP(μg/ml)PDGF-BB(ng/ml)GMP-140(ng/ml)VCAM-1(ng/ml)正常组10453.95±176.1853.79±20.4142.61±8.07167.62±36.23CIA组10844.44±159.95a134.14±36.54a104.52±14.14a456.48±74.31aTMP组10653.66±113.33b87.68±21.37b52.09±12.45b232.80±28.48bLEF组10563.27±88.78b68.06±36.71b91.74±10.35284.35±57.21bT+L组10489.66±88.94b59.32±22.08b56.07±10.61b224.68±81.21b,c,d

注：与正常组比较:aP<0.01；与CIA组比较:bP<0.05；与TMP组比较:cP<0.05；与LEF组比较:dP<0.01

3.3 各组大鼠血清CRP和PDGF- BB蛋白水平、血浆VCAM- 1蛋白水平和GMP- 140水平变化

表1显示，与正常组比较，CIA大鼠血清CRP和PDGF- BB蛋白水平、血浆VCAM- 1蛋白水平和GMP- 140水平均显著上升(P<0.01)；与CIA组比较，TMP、LEF、T+L组大鼠血清CRP和PDGF- BB水平均显著下降(P<0.05)；T+L组与TMP、LEF组比较有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；与CIA组比较，TMP、T+L组大鼠血浆GMP- 140水平均显著下降(P<0.05)，LEF组大鼠血浆GMP- 140水平与CIA大鼠比较差异无统计学意义(P>0.05)；与CIA组比较，TMP、LEF、T+L组大鼠血浆VCAM- 1水平均显著下降(P<0.01)；与TMP、LEF组比较，T+L组大鼠血浆VCAM- 1水平均显著下降(P<0.05)；TMP组与LEF组比较，VCAM- 1变化差异无统计学意义(P>0.05)。

4 讨论

RA属于中医“痹症”范畴。血瘀证是RA的基本病机之一。“血瘀”在RA发病过程中既可以成为主要的发病因素,又可作为其主要的病理机制而贯穿于整个疾病的始终[10]。现代研究发现，血瘀证与血小板活化密切相关，血小板的活化参与了血瘀证的发生发展过程，是血瘀证产生的重要病理生理基础[6]。

胶原诱导关节炎(collagen- induced arthritis,CIA)模型在关节肿胀、滑膜炎、骨膜新骨形成、关节股侵蚀和骨丢失等方面与人类RA非常接近，是研究人类RA和其他自身免疫性关节炎理想的动物模型[11]。

CRP在感染、炎症、组织损伤后主要由肝细胞大量分泌产生释放入血[12]，是临床评价RA病情活动及疗效的重要指标，在临床被广泛使用[13]。

GMP- 140被认为是血小板活化的特异性标志物[14]。GMP- 140可以介导内皮细胞与中性粒细胞及单核细胞的黏附功能，介导白细胞在内皮细胞上滚动，引起炎症反应同时激活血小板微颗粒，释放促炎因子IL- 1、IL- 6等炎性因子和更多的GMP- 140[15]，由此循环往复地促使RA滑膜炎症持续存在和病情的进展。

血管细胞间黏附分子(vascular adhesion molecule- 1，VCAM- 1)在非炎症状态表达很低，当受到炎症刺激时，与表达在单核细胞和嗜酸性粒细胞表面的α4β1整合素结合，使单核细胞、白细胞被捕获并黏附在内皮细胞表面，聚集于炎症局部。RA最重要的病理特征是持续存在的滑膜炎，具体表现为滑膜组织中炎性细胞的大量浸润和血管翳的形成，而黏附分子包括VCAM- 1和GMP- 140在炎性细胞向滑膜组织浸润侵袭中均发挥重要作用，是介导RA滑膜炎症过程中单核细胞与内皮细胞之间黏附的主要介质[16]。

血小板源生长因子(platelet- derived growth factor, PDGF)可以显著加重RA关节炎症，促进滑膜衬里层细胞的增生及加速骨破坏等作用[17]。PDGF还有很强的致炎性，可以促进IL- 1β诱导PGE2的合成增加，促进TNF- α上调滑膜细胞中IL- 8的表达，促进单核细胞、中性粒细胞活化并增强吞噬细胞吞噬能力等作用[18-19]。

有研究表明，激活的血小板脱颗粒是信号级联放大的过程[20]，其中a颗粒包含大量黏附蛋白、细胞因子、生长因子以及黏附受体，释放入血后引起炎症反应、细胞黏附等作用，从而放大血小板激活，募集外周血小板聚集，且可促进血栓的稳定[21]。另外研究表明，血小板活化能够诱导RA中单核细胞表型向促炎表型转变，促使单核细胞- 血小板聚合物的形成，诱导促炎因子瀑布式释放，尤其对处于活动期的RA患者，血小板活化对单核细胞的诱导作用更加明显[22]。由此可见，血小板活化与炎症反应之间相互影响，炎症反应可以诱导血小板活化，血小板活化也可以加速炎症反应的发生。在RA中，炎性反应与血小板活化之间相互作用，形成一个炎症- 血小板活化网络，共同影响RA疾病的进展。

本研究结果显示，CIA大鼠GMP- 140、VCAM- 1和PDGF- BB表达均显著升高，提示CIA大鼠血小板活化和炎症反应的发生，川芎嗪联合来氟米特可以显著降低GMP- 140、VCAM- 1和PDGF- BB，结果显示川芎嗪联合来氟米特可能通过显著抑制血小板活化和炎症反应的发生治疗RA，这与大鼠AI评分、关节病理及血清CRP水平结果一致，提示对于RA患者具有潜在的应用价值。

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Effect of Ligustrazine Combined with Leflunomide on Platelet Activation and Inflammatory Response in Collagen Induced Arthritis Rats

BAI Jing- an1, BIAN Yan- qin2, NIU Xu- yan1, FAN Dan- ping1, LV Cheng1, JIANG Miao1, ZHAO Ning1△

(1.Institute of Basic Research in Clinical Medicine，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 2. Shuguang Hospital,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China)

Objective: To explore the effect of combination therapy of tetramethylpyrazine(TMP) with leflunomide (LEF) on collagen induced arthritis(CIA) rats. Methods: Totally 50 male SD rats were stratified by body weight.Ten of them were randomly recruited as the normal control group.The rest 40 were established rheumatoid arthritis(RA) model.Forty successfully model rats were randomly divided into 4 groups,i.e.,the CIA group,the TMP group, the LEF group,and the TMP plus LEF group,10 in each group.Each drug intervention group was used corresponding scheme.Observing each joint pathological changes of rats, Serum Levels of CRP and PDGF- BB,and plasma levels of GMP- 140 and VCAM- 1 were detected.Results Compared with normal control group, the joint synovial of CIA rats appear obvious cell proliferation, inflammatory cells infiltration, pannus formation in cartilage. Serum levels of CRP and PDGF- BB,and plasma levels of GMP- 140 and VCAM- 1 were significantly increased. Compared with the CIA group, the drug intervention group rats joint pathological changes in synovial hyperplasia, inflammatory cells infiltration and pannus formation were improved, bone destruction significantly was reduced, T + L group effect is more significant. Arthritis index of rats were decreased of T + L combination group is better than TMP and LEF group. Double joint swelling, hind limbs of rats AI scores are less.Compared with TMP and LEF group, T + L AI value combination group rats significantly reduced; Serum levels of CRP and PDGF- BB were lower, and T + L effect is better than that of TMP and LEF group; plasma levels of GMP- 140 and VCAM- 1 were lower, T + L effect is superior to TMP and LEF group. Conclusion Combination of TMP with LEF could significantly inhibit platelet activation and inflammatory reaction of collagen induced arthritis rats，which has potential application value for RA patients.

Rheumatoid arthritis; Collagen induced arthritis; Combination therapy of tetramethylpyrazine with leflunomide; Platelet activation

国家自然科学基金面上项目(81573845)-从EphB/ephrinB2逆向信号调控滑膜及骨髓中破骨细胞分化探讨肾虚在绝经后RA发展中的作用;中国中医科学院基本科研业务费自主选题资助项目(Z0412)-川芎嗪联合氟米特治疗类风湿关节炎疗效分子机制研究

白菁安(1985-)，女，北京人，实习研究员，医学硕士，从事类风湿关节炎的病证关联研究。

R285.5

B

1006- 3250(2017)07- 0953- 04

2017- 01- 24

△通讯作者：赵 宁，副研究员，医学博士，从事类风湿关节炎的病证关联研究，Tel：15801013626,E- mail：zhaon2003@163.com。