布渣叶总黄酮大孔吸附树脂纯化工艺研究

李智勇，孙冬梅*，王洛临

(1.广东省中医药工程技术研究院，广东 广州 510095；2.广东省中医药研究开发重点实验室，广东 广州 510095)

布渣叶总黄酮大孔吸附树脂纯化工艺研究

李智勇1,2，孙冬梅1,2*，王洛临1,2

(1.广东省中医药工程技术研究院，广东 广州 510095；2.广东省中医药研究开发重点实验室，广东 广州 510095)

目的：确定布渣叶总黄酮(total flavonoids inMicrocospaniculataL.，TFMP)的大孔吸附树脂纯化工艺参数。方法：采用单因素试验法筛选适宜的大孔树脂；并对其纯化工艺条件进行优化。结果：D101分离TFMP的工艺条件为上柱药液浓度为0.15 g/mL，上柱流速0.5 BV/h，上样体积8.5 BV，树脂柱径高比为1∶8，以5 BV水洗脱，洗脱溶剂为80%的乙醇，洗脱流速1 BV/h，洗脱体积3.75 BV，大孔树脂可重复利用5次，TFMP纯化后含量达84.09%，精制度达220.03%。结论： D101可以用于富集，纯化TFMP。

布渣叶总黄酮；大孔吸附树脂；纯化工艺

布渣叶为椴树科植物破布叶(MicrocospaniculataL.)的叶，具有消食化滞，清热利湿等功效，主要含有黄酮、生物碱、三萜、挥发油等化合物。前期研究发现，布渣叶提取物能显著降低高脂血症小鼠模型血清中总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含有量，其中黄酮类化合物为其主要有效成分。本研究在前期布渣叶总黄酮提取研究的基础上[1]，采用大孔树脂进行纯化工艺研究，为其有关制剂提供物质基础。

1 仪器与试药

紫外分光光度计UV PC-2550(岛津)；Sartorius BP 211D电子分析天平；Agilent 6890-5973N GC-MS气质联用仪；Agilent 7694E顶空进样器；大孔吸附树脂:D101(天津市海光化工有限公司),AB-8(南开大学化工厂),HPD100、HPD300、HPD400、HPD450(河北沧州宝恩化工有限公司)。

布渣叶药材购于广州养和医药有限公司，经广东省中医药工程技术研究院孙冬梅主任中药师鉴定为正品；TFMP提取物(自制)；芦丁对照品(080-9303,中国药品生物制品检定所);药用乙醇(广宁县顺宁葡萄糖药业有限公司)；盐酸，氢氧化钠，亚硝酸钠，硝酸铝均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 TFMP的UV测定

2.1.1 对照品溶液的配制

精密称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品20.5 mg置100 mL容量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，制成每1 mL含0.205 mg芦丁的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的配制

取布渣叶提取物(约相当于2.5 g布渣叶)，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率200 W，频率40 KHz)1 h，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，即得[2]。

2.1.3 方法学考察

精密吸取对照品溶液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL，分别置25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液5 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min；以相应试剂为空白，测定500 nm处吸光度[2]，以吸光度(A)为纵坐标，浓度为横坐标(C)，绘制标准曲线，得回归方程A=0.011 49 C-0.009 64(r=0.999 63)，表明线性良好。取同一供试品溶液，在显色后5，10，15，20，25，30 min测定，结果显示经过20 min后吸光度明显下降，因此控制测定时间在显色后20 min以内。

2.1.4 测定法

精密量取供试品溶液0.2 mL，置25 mL容量瓶中，照“2.1.3”项下的方法，自“加水至6 mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读取浓度，计算总黄酮含量。经测定，本实验用布渣叶中总黄酮含量为6.81%。

2.2 TFMP的大孔吸附树脂纯化工艺研究

2.2.1 布渣叶提取液的制备

取布渣叶500 g，照优选的提取工艺提取，回收乙醇，浓缩至无醇味，加入一倍量的蒸馏水，搅匀，静置过夜，滤过，沉淀物用水洗涤2次，洗涤液与滤液合并，置1 000 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。依法测定吸光度并计算总黄酮的得率为6.29%。

2.2.2 大孔吸附树脂的选择[3]

称取已预处理[4]的HPD100、HPD300、HPD400、HPD450、AB-8、D101等大孔吸附树脂各3 g，置100 mL具塞三角瓶中，加入30 mL布渣叶提取液，摇床振摇12 h，过滤，大孔吸附树脂以30 mL水洗涤，合并水洗液和滤液，转移至100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，备用；树脂转移至100 mL具塞三角瓶中，加入乙醇25 mL，超声处理(功率200 W，频率40 KHz)15 min，取出，放置3 h，过滤，继续加乙醇洗涤至洗出液呈无色，合并滤液和洗涤液，转移至100 mL量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，备用；分别测定吸光度，计算比吸附量，比洗脱量和解吸附率，结果如表1。

表1 不同大孔吸附树脂对TFMP的吸附考察

注：比吸附量=(上样量-残余量)/树脂重量；比洗脱量= 醇洗脱量/树脂重量；解吸附率(%)=醇洗脱量/吸附量×100%。

结果可知，除HPD450的比吸附量和比洗脱量相对较低外，其余均无显著差异，但从解吸附率来看，D101型的解吸附率优于其他各型号，确定选用D101。

2.3 吸附条件优化

2.3.1 上样液pH值对D101总黄酮吸附率的影响[5]

取布渣叶提取液(pH值为3.4)，加入稀HCl试液或稀NaOH试液，调节使pH值分别为2、4、6、8，吸取原液和各pH值溶液各20 mL，置入已称取2 g D101的三角瓶中，轻轻振摇，并放置过夜，过滤，D101以30 mL水洗涤，合并，转移至50 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，依法测定吸光度，计算总黄酮吸附率[计算公式：吸附率(%)=(上样量-残余量)/上样量×100%]。结果上样药液pH值2、3.4、4、6、8时TFMP吸附率分别为93.86%、92.19%、87.56%、88.4%、91.38%，考虑到生产的方便性和实际操作性，选用原液(pH值3.4)上样。

2.3.2 上样浓度对D101总黄酮吸附率的影响[6]

取布渣叶提取液，分别加水稀释成每毫升含总黄酮10.76、7.17、4.30、2.69 mg的溶液，以0.5 BV/h的速度通过D101树脂柱，收集流出液，转移至50 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，依法测定吸光度，结果 计算得总黄酮吸附率分别为91.67%、90.05%、92.98%、96.83%，考虑上样浓度过低明显增加上样时间，选择上样浓度10.76 g/L(约每毫升含0.15 g生药)。

2.3.3 上样流速对D101总黄酮吸附率的影响

取布渣叶提取液(每毫升含0.15 g生药)，分别以0.5、1、2、3 BV/h的流速通过D101树脂柱，分别收集流出液，转移至50 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，依法测定吸光度，计算得总黄酮吸附率分别为89.02%、82.23%、79.72%、67.75%，故选择上样流速为0.5 BV/h。

2.3.4 树脂柱径高比对D101纯化TFMP的影响

称取D1015份，湿法装于不同的玻璃柱中，使径高比分别为1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10，各取6 BV的布渣叶提取液(0.15 g/mL)，以0.5 BV/h的速度通过树脂柱，收集残余液；取蒸馏水以1 BV/h的速度洗脱至无色，收集水洗液；再以80%乙醇洗至无色，收集醇洗液；残余液，水洗液和醇洗液，分别浓缩至适量，转移至100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，依法测定吸光度，并计算吸附残余率，水洗损失率，总黄酮得率及其总和，结果如表2，选择径高比为1∶8。

表2 树脂柱径高比对D101纯化TFMP的影响

注：吸附残余率(%)=吸附残余量/上样量×100%； 水洗损失率(%)=水洗损失量/上样量×100%；总黄酮得率(%)=醇洗脱量/上样量×100%；总和(%)=吸附残余率+水洗损失率+总黄酮得率。

2.3.5 吸附泄漏曲线的考察

取布渣叶提取液，以0.5 BV/h的流速通过D101树脂柱(柱体积约20 mL)，分段收集流出液，每份10 mL，依法测定吸光度，计算总黄酮浓度，并绘制泄漏曲线图(如图1)。结果显示，在上样体积180 mL处流出液总黄酮浓度达到47.71 mg/L，约相当于170 mL处流出液浓度25.65 mg/L的2倍，确定上样溶液的体积为170 mL，约为8.5 BV。

图1 TFMP泄露曲线

2.4 洗脱条件优选

2.4.1 不同浓度醇溶液对总黄酮静态解吸附的影响

称取D1016份，每份3 g，分别置于100 mL具塞的三角瓶中，加入布渣叶提取30 mL，时时振摇，放置过夜，使充分吸附，滤过，D101水洗至无色，抽干，分别加入对应浓度为40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇各20 mL，摇床振摇6 h后，滤过，并以相同浓度的乙醇分别洗涤，合并洗涤液和滤液，转移至50 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀。依法测定吸光度，计算。结果总黄酮得率分别为50.18%，63.88%，74.5%，75.57%，82.64%，76.57%。故选用80%乙醇作为洗脱溶剂。

2.4.2 洗脱速度对总黄酮得率的影响

取布渣叶提取液4份，分别以0.5 BV/h通过D101树脂柱，分别用8倍量80%乙醇分别以0.5、1.0、2.0、3.0 BV/h流速洗脱，收集洗脱液，依法测定吸光度，计算得总黄酮得率分别为86.49%、83.59%、76.01%、69.65%，表明随着洗脱流速加大，总黄酮得率呈下降趋势，兼顾生产效率和生产实际可操作性，选择洗脱速度为1 BV/h。

2.4.3 洗脱体积的选择[7]

取布渣叶提取液，以0.5 BV/h的流速通过D101树脂柱，再用80%乙醇以1 BV/h的流速洗脱，分段收集洗脱液，每份5 mL，依法测定吸光度，计算洗脱液中的总黄酮含量和洗脱体积，并绘制洗脱曲线，结果如图2。由洗脱曲线可知，当洗脱体积达到45 mL时洗脱液中总黄酮的含量趋近于洗脱平衡，因此可确定洗脱体积为45 mL(约3.75 BV)。

图2 TFMP洗脱曲线

2.5 D101再生重复使用次数考察[7]

根据确定的D101吸附条件，重复多次吸附与解吸附，每次解吸附后用95%乙醇和蒸馏水依次进行洗脱再生，再进行下一次试验。分别收集各次80%乙醇洗脱液，依法测定吸光度，计算总黄酮得率。

总黄酮得率(%)=醇洗脱量/上样量×100%

表3 D101不同再生重复使用次数总黄酮得率(n=2)

结果如表3所示，新D101的总黄酮得率与重复再生1，2，3，4，5次的总黄酮得率差别不大，在重复使用6次后，总黄酮得率明显下降，不利于总黄酮的富集。因此D101重复利用5次可以保证吸附效果。

2.6 验证试验

按照确定的纯化工艺进行3次验证试验(投药量分别为1 kg、5 kg、20 kg)，结果显示，TFMP纯化前总黄酮的平均得率为药材的4.10%，总黄酮平均含量为38.22%，RSD为0.04%(n=3)，纯化后的平均含量为84.09%，RSD为2.16%(n=3)，精制度达220.03%[精制度(%)=纯化后总黄酮含量/纯化前总黄酮含量×100%]。说明该纯化工艺稳定，可靠。

3 小结与结论

本研究基于将布渣叶总黄酮提取物用于医药用途，因此在提取、纯化、分离工艺中选择溶剂时尽量避开易燃易爆、毒性较强的有机溶媒，而选用药用乙醇等作为溶剂，以便利于后续纯化和药品生产。并在前期提取的研究基础上，采用单因素考察法对TFMP的大孔树脂纯化工艺参数进行了筛选，确定了其纯化工艺，结果显示其精制度达220.03%，说明采用D101可以较好地富集，纯化布渣叶总黄酮，从而为其进一步制剂奠定基础。

[1] 谭志灿.广东道地药材布渣叶质量评价及调血脂物质基础研究[D].广州:广州中医药大学,2012:66-69.

[2] 潘天玲,李坤平,贲永光,等.正交试验法优化布渣叶总黄酮提取工艺的研究[J].广东药学院学报,2008,24(5):454-456.

[3] 葛亮,豆浩然,张晋,等.天山雪莲黄酮类成分大孔树脂纯化工艺优选[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(7):1-3.

[4] 贾存勤,李阳春,屠鹏飞,等.D-101型大孔吸附树脂预处理方法的研究[J].中草药,2006,37(2):193-196.

[5] 王桂玲,房建强,赵雪梅,等.拳参总黄酮的纯化研究[J].医药导报,2011,30(2):190-193.

[6] 张华潭,郑文丽,魏艳婷,等.大孔树脂纯化黄蜀葵花总黄酮的工艺优选[J].中国实验方剂学杂志,2015,21(1):28-31.

[7] 张崇禧,郑友兰,张春红,等.大孔树脂吸附人参总皂苷工艺及再生使用的研究[J].中国药学杂志,2003,38(9):23-26.

PurificationProcessofTotalFlavonoidsinMicrocosPaniculatawithMacroporousAdsorptionResin

LIZhi-yong1,2,SUNDong-mei1,2*,WANGLuo-lin1,2

(1.GuangdongProvinceEngineeringTechnologyResearchInstituteofT.C.M.，Guangzhou510095,China; 2.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofR&DinT.C.M.，Guangzhou510095,China)

Objective: To determine the parameters of purification process of total flavonoids inMicrocospaniculataL.(TFMP)with macroporous resin. Methods: Single factor test was used to choose the suitable macroporous. Optimize the purification process conditions. Results: D101isolated TFMP process conditions on the concentration was 0.15 g/mL; the flow rate was 0.5 BV/h; the sample volume was 8.5 BV; resin column diameter to height ratio was 1∶8; with 5BV water washed; 3.75 BV ethanol 80% with flow rate 1 BV/h, microporous resin could be reused for 5 times; the purification of TFMP reached 84.09%, up to 220.03% of refining. Conclusion: D101can be used to enrich and purify TFMP.

Total flavonoids inMicrocospaniculataL.; Macroporous adsorption resin; Purification process

广东省科技计划项目重大科技专项项目(No.2012A080202016)

李智勇(1977-)，男，博士，主任中药师，主要研究方向：中药制剂及质量标准研究。

孙冬梅*(1969-)，女，教授，博士研究生导师，主任中药师，主要研究方向：中药质量评价研究。

2016-09-01

修回日期：2016-09-15

R284

：A

：1002-2406(2017)05-0024-04