乌腺金丝桃对佐剂性关节炎模型大鼠血清中IL-17、PGE2、MMP-9、IFN-γ含量的影响

朱洁宜，吴鑫宇，潘军英，付新，李冀*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

乌腺金丝桃对佐剂性关节炎模型大鼠血清中IL-17、PGE2、MMP-9、IFN-γ含量的影响

朱洁宜1，吴鑫宇1，潘军英2，付新1，李冀1*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：探讨乌腺金丝桃治疗类风湿关节炎的作用机制。方法：复制佐剂性关节炎(AA)大鼠模型，随机分为空白组、模型组、乌腺金丝桃高剂量组、乌腺金丝桃低剂量组、雷公藤多苷片阳性对照组，采用酶联免疫(ELISA)法检测各组大鼠血清中细胞因子白介素17(IL-17)、前列腺素E2(PGE2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、干扰素γ(IFN-γ)的含量。结果：乌腺金丝桃高剂量组和低剂量组AA大鼠血清中IL-17、PGE2、MMP-9、IFN-γ的含量与模型组相比显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论：乌腺金丝桃治疗类风湿关节炎的作用机制可能与降低IL-17、PGE2、MMP-9、IFN-γ含量有关。

乌腺金丝桃；佐剂性关节炎大鼠模型；类风湿关节炎;IL-17；PGE2；MMP-9；IFN-γ

类风湿关节炎(RA)是以侵蚀性、对称性多关节炎为主要临床表现的慢性、全身性自身免疫性疾病[1-2]。目前发病机制不明，难治性、复发性、致残性贯穿该病的始终。该疾病的基本病理表现为滑膜炎和血管翳的形成，后期常会出现关节软骨和骨破坏，导致关节变形，使人致残，该病无法治愈，所以对于控制病情的有效药物研究一直在进行。中医药治疗RA有着悠久的历史，且中药具有毒副作用小等优势[3-4]。乌腺金丝桃为民间常用中草药，味苦，性平，归心、肝经，有镇痛的功效，主治风湿关节痛。本研究复制佐剂性关节炎大鼠模型，观察IL-17、PGE2、MMP-9及IFN-γ含量的变化,意在探讨乌腺金丝桃治疗RA的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

健康SD雄性大鼠50只，体质量(200±20)g，由黑龙江中医药大学安全评价中心(GLP)提供;乌腺金丝桃(黑龙江中医药大学方剂学实验室提供)；完全弗氏佐剂(Sigma公司)；雷公藤多苷片(上海复旦复华药业有限公司，国药准字Z31020415)；旋转蒸发器(上海申胜生物技术有限公司)；低速离心机(科大创新股份有限公司中加分公司)；ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；i-control Infinite 200 Pro多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组

将SD大鼠随机分为空白组、模型组、乌腺金丝桃高剂量组(以下简称高剂量组)、乌腺金丝桃低剂量组(以下简称低剂量组)、雷公藤多苷片阳性对照组(以下简称阳性组)，每组10只。

1.2.2 模型制备

除空白组外，其余各组每只大鼠左后足拉直并于左后足跖皮下注射完全弗氏佐剂0.1 ml。

1.2.3 药物制备

乌腺金丝桃全草剪碎，用16倍量蒸馏水浸泡60 min，冷凝回流提取药液60 min并过滤，剩余药渣用14倍量蒸馏水再次提取药液40 min后滤出；剩余药渣再以10倍量95%乙醇提取药液30 min，再进行一次30 min醇提，滤出，将4次水醇提取的药液混合，并用旋转蒸发器浓缩至所需的浓度，放置冰箱4℃保存。

雷公藤多苷片研成粉末与蒸馏水充分混匀，制成浓度为0.1%的雷公藤多苷片混悬液，并加入0.01% 的悬混剂羧甲基纤维素钠，放置冰箱4℃保存。

1.2.4 给药方法

造模7日后开始灌胃给药，每日1次，低剂量组灌服1.44 g/kg乌腺金丝桃提取液，高剂量组灌服5.76 g/kg乌腺金丝桃提取液[5-7]，阳性组灌服9.45 mg/kg雷公藤多苷片混悬液，空白组、模型组以1.0 ml/100 g灌服生理盐水，每组均连续给药21天。

1.3 血清中IL-17、PGE2、MMP-9、IFN-γ的含量测定

末次给药后24 h内大鼠禁食禁水，之后全部大鼠称重，腹腔注射20%乌拉坦麻醉大鼠(5 mlkg)，经颈总动脉取血，将血置于采血管中，3 000 rmp离心15 min，取上清，保存于-20℃冰箱，采用ELISA法检测。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠血清中IL-17、PGE2的含量比较

由表1可知，模型组大鼠血清IL-17、PGE2的含量明显升高，与空白组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。而高、低剂量组和阳性组大鼠血清中IL-17、PGE2的含量均有所下降，与模型组比较，差异具差异显著(P<0.05或P<0.01)。

表1 各组大鼠血清IL-17、PGE2的含量比较

注：与空白组比较，△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 各组大鼠血清中MMP-9、IFN-γ的含量比较

由表2可知，模型组大鼠血清中MMP-9、IFN-γ的含量明显升高，与空白组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)；低剂量组大鼠血清中MMP-9、IFN-γ的含量与模型组相比差异显著(P<0.05)，而高剂量组、阳性组大鼠血清中MMP-9、IFN-γ的含量与模型组比较，具有极显著性差异(P<0.01)。

表2 各组大鼠血清MMP-9、IFN-γ的含量比较

注：与空白组比较，△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

RA的发病机制尚未完全明确，但相关研究表明其发病机制与一些细胞因子密切相关。

IL-17主要由Th17细胞分泌，其参与RA的炎症反应和进行性损坏可通过多种途径实现[8]。IL-17常通过与其他细胞因子的相互作用来促进炎症反应，从而介导炎症细胞浸润关节以致组织损伤[9]。还有研究表明,IL-17能促进滑膜血管的增生，加重关节破坏，这是通过诱导滑膜细胞产生金属蛋白酶实现的[10]。本研究显示,乌腺金丝桃可下调IL-17的含量，说明对抑制RA的炎症和骨破坏有一定的作用，也通过这一机制证明了其治疗RA的可能性。

花生四烯酸经环氧化酶代谢产生前列腺素，而前列腺素的合成与释放体现在炎症反应的全过程中。组织损伤和多种关节炎性疾病的产生与PGE2介导蛋白水解酶和炎性因子的产生是息息相关的[11]，而RA的炎性渗出与PGE2改变血管通透性亦有关[12]。阻断PGE2的产生可以治疗RA，非甾体抗炎药就是通过此途径来发挥药效的。本实验结果发现，乌腺金丝桃可降低PGE2的含量，说明PGE2可能是乌腺金丝桃治疗的RA机制之一。

MMP-9是MMPs家族的成员，属明胶酶类，有研究表明干扰素α可促进单核巨噬细胞MMP-9的合成，加强炎性细胞的侵袭力，造成RA骨和软骨的破坏[13]，而血清MMP-9也可作为暂无骨破坏RA患者的早期预测指标[14]，亦有研究发现血管翳的形成与MMP-9促使滑膜下层血管生成有关[15]。本实验研究发现，乌腺金丝桃高、低剂量组可明显降低模型大鼠血清中MMP-9的含量，证明其可能通过MMP-9这一机制参与了RA的治疗。

IFN-γ是有着广泛免疫调节作用的干扰素，与关节炎的发病密切相关[16]，可刺激并增强RA的炎症反应，参与关节软骨等组织的损伤，且作为免疫刺激因子可以促使CD4+Th细胞向Th1细胞的极化，促使免疫系统活化[17]。还有动物实验表明，下调血清及滑膜中IFN-γ的表达，利于平衡Th1/Th2细胞，从而抑制滑膜局部细胞及体液免疫反应,减轻关节滑膜炎和血管病变[18]。本实验结果表明，乌腺金丝桃高、低剂量组可明显下调模型大鼠血清中IFN-γ的含量，说明IFN-γ可能是乌腺金丝桃治疗RA的作用机制之一，这为乌腺金丝桃治疗RA的下一步深入研究提供了平台。

乌腺金丝桃，又名稳心草、赶山鞭，味苦，性平，归心、肝经，有止血、镇痛、通乳的功效，主治咯血、吐血、子宫出血，风湿关节痛，跌打损伤，神经痛，乳腺炎，乳汁缺乏，外用时常用来治疗疔疮肿毒和外创出血。之前对于乌腺金丝桃的研究多集中在化学成分、治疗心脏病、抗抑郁等方面[19-20]，本研究从新的角度出发，分析其治疗RA的可能性。而从本实验结果来看，乌腺金丝桃可从抗炎、调节免疫、抑制骨破坏等方面发挥其治疗RA的功效[21]，这不仅为接下来的深入研究提供了基础，更为临床治疗RA的用药提供了新思路。

[1] 葛均波,徐永健.内科学[M].8版.北京:人民卫生出版社,2013:808.

[2] 朱洁宜,吴鑫宇,周海纯,等.中医药治疗类风湿关节炎的研究进展[J].中医药信息,2015,32(1):115-117.

[3] 孙焱,于慧敏.姜黄素治疗类风湿关节炎作用机制研究进展[J].中医药学报,2015,43(6):113-116.

[4] 于天一,程伟.浅论传统中医学在现代临床治疗体系中的作用及其影响——以痹证(类风湿关节炎)治疗手段为例[J].中医药学报,2015,43(5):4-7.

[5] 李冀,吴全娥,高彦宇,等.乌腺金丝桃对抑郁症大鼠海马单胺类神经递质含量5-HT及5-HIAA的影响[J].中医药信息,2012,29(5):18-20.

[6] 叶绿萍,黄志俭,刘小意,等.赶山鞭水提取物及醇提取物毒性及抗炎镇痛作用[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(17):204-205.

[7] 黑龙江省呼盟地方病防治研究所.稳心草对慢型克山病初步治疗观察[J].黑龙江医药,1976,(z1):46-48.

[8] Langrish CL,Chen Y,Blumenschein WM,et al.IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation[J].J Exp Med,2005,201(2):233-240.

[9] 钱雷,吕丽君,徐敏,等.活化的类风湿关节炎患者外周血单个核细胞Toll 样受体4诱导Th17细胞分化[J].中华风湿病学杂志,2011,15(12):816-820.

[10] Zhu J,Paul WE.CD4 T cell:fates,function,and faults[J].Blood,2008,112(5):1557-1569.

[11] Kojima F,Kato S,Kawai S.Prostaglandin E synthase in the pathophysiology of arthritis[J].Fundam Clin Pharmacol,2005,19(3):255-261.

[12] 莫书蓉,孟宪丽.舒筋活络胶囊对佐剂关节炎大鼠的作用及部分机理研究[J].中药药理与临床,2008,24(2):68-70.

[13] 谢建民,王好问,陆才生.TNF-α上调单核巨噬细胞MMP-9的活性与类风湿关节炎关节破坏的关系[J].中国病理生理杂志,2009,25(6):1181-1185.

[14] 吴振彪,卢宁,王彦宏,等.基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9与类风湿性关节炎关节破坏的关系[J].中国免疫学杂志,2006,22(3):260-262.

[15] Jackson C,Nguyen M,Arkel J,et al.Selective matrix metalloproteinase(MMP)inhibition in rheumatoid arthritis-targetting gelatinase A activation[J].Inflamm Res,2001,50(4):183-186.

[16] Simon A,Seipe1 T,Sieper J.Divergent T cell cytokine patterns in inf1ammatory arthritis[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:292.

[17] Palmer G,Mezin F,Juge-Aubry CE,et al.Interferon beta stimulates interleukin 1 receptor antagonist production in human articular chondrocytesand synovial fibroblasts[J].Ann Rheum Dis,2004,63(1):43-49.

[18] 曹炜,姜泉,吴振宇,等.风湿清对Ⅱ型胶原诱发类风湿关节炎大鼠白细胞介素-4、γ-干扰素及趋化因子的影响[J].中国中西医结合杂志,2009,29(12):1114-1116.

[19] 马育轩,王艳丽,周海纯,等.乌腺金丝桃的化学成分及药理作用研究进展[J].中医药学报,2012,40(6):125-126.

[20] 李冀,闫东,潘若凡,等.乌腺金丝桃抗快速型心律失常活性成分作用机制研究[J].中医药学报,2013,41(1):9-10.

[21] 吴鑫宇,高彦宇,朱洁宜,等.乌腺金丝桃对类风湿关节炎大鼠NO及VEGF表达的影响[J].中医药信息,2016,33(4):4-6.

EffectofHypericumAttenuatumChoisyonSerumLevelsofIL-17,PGE2,MMP-9andIFN-γinAdjuvantArthritisRats

ZHUJie-yi1，WUXin-yu1，PANJun-ying2,FUXin1,LIJi1*

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective:To investigate the mechanism of Hypericum Attenuatum Choisy(HAC) in the treatment of rheumatoid arthritis. Methods:The rats were randomly divided into the blank group, the model group, the high-dose HAC group, the low-dose HAC group, and the Tripterygium glycosides group. Adjuvant arthritis(AA) model was established in the other four groups except the blank group. The contents of interleukin 17(IL-17), prostaglandin E2(PGE2), matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) and interferon γ (IFN- γ) in serum were tested by ELISA method. Results: The contents of IL-17, PGE2, MMP-9, and IFN- γ in the high-dose HAC group and the low-dose HAC group were significantly decreased compared to those in the model group(P<0.05 orP<0.01). Conclusion:The mechanism of HAC in the treatment of rheumatoid arthritis may be related to modulating IL-17, PGE2, MMP-9, IFN-γ.

Hypericum Attenuatum Chosiy; Adjuvant arthritis model rats; Rheumatoid arthritis;IL-17;PGE2;MMP-9;IFN-γ

国家自然科学基金项目(No.81373536);黑龙江中医药大学科研基金面上项目(No.201722)

朱洁宜(1988-)，女，黑龙江中医药大学2015级中医内科学专业博士研究生。

李冀*(1960-)，男，教授，博士研究生导师，主要研究方向:方剂配伍规律及作用机理研究。

2016-12-16

修回日期：2016-12-30

R285.5

：A

：1002-2406(2017)05-0013-03