HPLC-PDA法同时测定痛泻要方中五种有效成分

王艳宏，张秋樾，历凯，王智，旺建伟*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.哈尔滨市食品药品监督管理局，黑龙江 哈尔滨 150036；3.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

质量工艺

HPLC-PDA法同时测定痛泻要方中五种有效成分

王艳宏1，张秋樾1，历凯2，王智3，旺建伟1*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.哈尔滨市食品药品监督管理局，黑龙江 哈尔滨 150036；3.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

目的：建立HPLC-PDA方法同时测定痛泻要方水煎液中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍药苷，芍药内酯苷五种有效成分的含量。方法：采用Thermo Fisher C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色谱柱，白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍药苷，芍药内酯苷以乙腈(A)-水(B)为流动相梯度洗脱，运行时间：32 min；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：白术内酯Ⅰ及白术内酯Ⅲ为222 nm，白术内酯Ⅱ为278 nm；芍药苷、芍药内酯苷为232 nm；进样量：10 μL。结果：对检测结果进行线性考察，以峰面积(Y)与浓度(X)进行线性回归，结果表明白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在0.032～0.320μg之间线性关系良好，芍药苷、芍药内酯苷在0.6～6.0μg之间线性关系良好(r≥0.999 5)，平均加样回收率分别为：100.16%(RSD=2.7%)，100.01%(RSD=1.7%)，99.95%(RSD=1.5 %)，99.57%(RSD=0.5%)，99.34%(RSD=0.9%)；供试品在24 h内稳定；痛泻要方中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍药苷，芍药内酯苷含量分别为(n=3)：0.043 6、0.037 0、0.155 7、4.688 7、1.524 5 mg/g。结论：建立HPLC-PDA方法可同时测定痛泻要方中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍药苷，芍药内酯苷的含量，该方法简单便捷，重复性好，可用于痛泻要方的质量控制评价。

HPLC-PDA；痛泻要方；白术内酯Ⅰ；白术内酯Ⅱ；白术内酯Ⅲ；芍药苷；芍药内酯苷

痛泻要方又名白术芍药散，为《景岳全书》所载经典名方，由白术(炒)、白芍(炒)、陈皮、防风等四味中药组成。方中白术健脾燥湿,白芍缓急止痛,陈皮理气和中,防风散肝舒脾;四药相配，可以补脾土而泻肝木，调气机以止痛泻，能够治疗腹痛泄泻，结肠炎。有研究表明对治疗肝郁脾虚型肠易激综合征(Irritable bowel syndrome，IBS)有着独特的优势[1-4]。

目前已有大量文献研究报道了痛泻要方的药理作用及其治疗肠易激综合征的机制(调节脑肠轴、改善内脏感觉高敏感、调节免疫功能、抑制肠道平滑肌收缩、调控水通道蛋白表达、保护肠黏膜屏障等)[5-6]，而对于其质量控制研究较少见。通过对中药材，饮片，提取物，单方及复方制剂中的质量标志物进行定性定量分析来实现对中药的质量控制已被广泛接受[7-9]，在该复方中白术-白芍药对为该方发挥疗效的重要支撑[10]，因而本文将白术、白芍中的主要有效成分白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍药苷，芍药内酯苷定为目标成分，首次采用HPLC-PDA方法对痛泻要方水煎液中上述五种成分进行同时定量分析，实现对痛泻要方的质量控制研究，为相关质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试剂

Thermo fisher Ultimate 3000 UHPLC高效液相色谱仪(美国Thermo fisher科技有限公司)；ALC110.4十万分之一电子天平(北京赛多利斯系统有限公司)；KQ-800KDE超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；RE52CS-2旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵、B-260恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)。

分析甲醇(批号20160322，天津市富宇精细化工有限公司)；色谱乙腈(批号R141201，50101 DiKMA 美国)；蒸馏水(批号20160516，屈臣氏)。

1.2 对照品与供试药材

对照品白术内酯Ⅰ(批号111975-201501)、白术内酯Ⅱ(批号111976-201501)、白术内酯Ⅲ(批号111978-201501)、芍药苷(批号150726)，中国食品药品检定研究院，质量分数均≥98%；芍药内酯苷(批号wkq16060804)，四川省维克奇生物科技有限公司，质量分数≥98%。

白术、白芍、陈皮和防风药材均购自哈尔滨市盛泰中药饮片厂，经黑龙江中医药大学药学院孙慧峰教授鉴定,为菊科植物白术(AtractylodesmacrocephalaeKoidz)的干燥根茎，毛茛科植物芍药(PaeoniaelactifloraPall.)的干燥根，芸香科植物橘(CitrireticulataeBlanco)的干燥成熟果皮，伞形科植物防风(Saposhnikoviaedivaricata (Turcz.)Schischk.)的干燥根。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备

分别称取白术81 g，白芍54 g，陈皮41 g，防风27 g，用10倍量的蒸馏水浸泡0.5 h后煎煮2次，第1次煎煮1.5 h，第2次煎煮1 h，合并两次滤液，减压回收至干，取0.5 g精密称定，加甲醇适量超声溶解，定容至5 mL，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.2 混合对照品溶液的制备

分别取白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍药苷、芍药内酯苷对照品适量，精密称定，用甲醇溶解制成含白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ0.16 mg/mL，含芍药苷，芍药内酯苷3.00 mg/mL的混合对照品储备液，4℃冰箱储存备用。

2.1.3 阴性对照品溶液的制备

白术中含有白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，白芍中含有芍药苷和芍药内酯苷，按处方分别制备不含白术、白芍的供试品，按“2.1.1”项下方法制备阴性供试品溶液。

2.2 色谱条件及系统适应性

色谱柱：Thermo Fisher C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)，流动相为乙腈(A)-水(B)梯度洗脱：0～8 min：90%～80% B，8～10 min：80%～70%B，10～13 min:70%～40%B，13～23 min：40%～30%B，23～26 min：30%～20%B，26～28 min：20%～60%B，28～30 min：60%～90%B，30～32 min：90%B；运行时间：32 min；柱温：30℃；流速：1.0 ml/min；检测波长：白术内酯Ⅰ及白术内酯Ⅲ为222 nm，白术内酯Ⅱ为278 nm，芍药苷，芍药内酯苷为232 nm；进样量：10 μl。取混合对照品溶液，供试品溶液，阴性样品溶液在上述色谱条件下进行分析，色谱图见图1，理论塔板数均>7 000。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察

精密吸取“2.1.2”项下混合对照品储备液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0 ml置于10 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到系列质量浓度的混合对照品溶液，在“2.2”条件下进样分析，以峰面积(Y)对质量浓度(X)进行线性回归，得回归方程，结果见表1。表明各成分在线性范围内线性关系良好。

表1 5种成分线性关系

2.3.2 专属性试验

精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各10 μl，在“2.2”条件下进样分析，发现阴性供试品与对照品色谱图相比，在相应的保留时间处阴性供试品未见吸收峰，表明处方中其他药味对测定结果无干扰，色谱图结果见图1。

图1 HPLC色谱图注：1.芍药内酯苷；2.芍药苷；3.白术内酯Ⅲ；4.白术内酯Ⅰ；5.白术内酯Ⅱ。

2.3.3 精密度试验

精密吸取“2.1.2”下的混合对照品溶液10 μl，在“2.2”色谱条件下连续进样6次 ，测得白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍药苷、芍药内酯苷峰面积的RSD(n=6)值分别为0.4%，0.5%，0.3%，0.6%，0.4%，结果表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验

取同一批次痛泻要方样品(150505)6份，每份0.5 g，按“2.1.1”条件制备供试品溶液，在“2.2”色谱条件下进样，计算白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍药苷、芍药内酯苷含量的RSD(n=6)值分别为1.2%，1.5%，1.6%，1.3%，1.8%，结果表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验

取痛泻要方供试品溶液分别在0、2、4、6、12和24 h按“2.2”色谱条件下进行测定，计算白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍药苷、芍药内酯苷的峰面积的RSD值均小于2.0%,结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.6 加样回收试验

取同批(150601)已知白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、芍药苷、芍药内酯苷含量的痛泻要方样品6份，每份0.25 g，加入含有白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍药苷，芍药内酯苷浓度分别为10.18 μg/mL、9.28 μg/mL、27.95 μg/mL、1 000.53 μg/mL、383.78 μg/mL的混合对照品1 mL。按“2.1.1”条件下制成供试品溶液，按“2.2”色谱条件进行测定，计算平均回收率，结果痛泻要方中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍药苷、芍药内酯苷的平均加样回收率分别为100.16%(RSD=2.7%)，100.01%(RSD=1.7%)，99.95%(RSD=1.5 %)，99.57%(RSD=0.5%)，99.34%(RSD=0.9%)，结果见表2。

2.3.7 样品含量测定

将5批痛泻要方样品，平行称量3份，每份0.5 g，按“2.1.1”制成的供试品溶液，取10 μl，在“2.2”条件下进样分析，通过回归方程，计算含量(mg/g)，结果见表3。

3 讨论

本研究在提取方式上选取传统的水煎液方式。最传统的中药剂型有膏、丹、丸、散、汤，千百年来沿用至今，而目前中药汤剂依然是中药给药的主流途径，原因是其价格较中成药，中药颗粒剂廉价，患者可自制，方便易得[11]，另外通过有效成分的定量定性分析来实现复方水煎液的质量控制的相关报道较少，故本文采用最传统的水煎液的提取方式。在色谱条件选择方面，通过比较甲醇-水，甲醇-0.1%磷酸，乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸，发现在乙腈-水条件下，五种有效成分的峰形，分离度较好，干扰较少，又因五种成分的极性不同，故本文选用在乙腈-水的条件下梯度洗脱的方式。在波长选择方面，根据在210～400 nm范围内的五种成分紫外吸收情况，结果发现白术内酯Ⅰ、Ⅲ在222 nm处有最大吸收，白术内酯Ⅱ在278 nm处有最大吸收，芍药内酯苷和芍药苷在232 nm处有最大吸收，与文献报道一致[12-14]，故选用“2.2”项下的检测波长进行测定。

表2 加样回收率试验结果(n=6)

表3 样品含量测定结果(mg/g，n=3)

本实验采用HPLC-PDA法首次尝试对痛泻要方水煎液中白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、芍药苷、芍药内酯苷的含量同时测定，结果表明该方法快速简捷，准确可靠。含量测定结果显示不同批次药材之间测得的复方中有效成分的含量存在差异，也会导致疗效存在差异[15-16]，这与药材源于不同的产地，药材质量有关，大量文献总结可得出相同的结论[17-18]，这为药材的选择优化提供科学依据。

综上所述，本实验建立的HPLC-PDA法能够同时测定上述五种有效成分的含量，快速准确，重复性良好，可用于痛泻要方的质量控制研究。

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SimultaneousDeterminationofFiveEffectiveConstituentsinTongxieYaofangbyHPLC-PDA

WANGYan-hong1,ZHANGQiu-yue1,LIKai2,WANGZhi3,WANGJian-wei1*

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 2.HarbinFoodandDrugAdministration,Harbin150036,China;3.TheSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150001,China)

Objective:To establish an HPLC-PDA method for the simultaneous determination of five effective constituents(atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III, paeoniflorin, and albiflorin)in Tongxie Yaofang decoction. Method:The column of Thermo Fisher C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm) was used, atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III, paeoniflorin and albiflorin were eluted with acetonitrile (A)-water (B) as the gradient mobile phase; running time was 32mins; column temperature was 30℃; and the flow rate was 1.0 mL/min; the detection wavelengths were set at 222nm for atractylenolide I and atractylenolide III, 278nm for atractylenolide II, and 232nm for paeoniflorin and albiflorin; and the sample size was 10 μL. Results: Linear investigation of test results was performed with peak area (Y) and concentration (X), the result showed that the atractylenolide I, atractylenolide II, and atractylenolide III had good linearity in the range of 0.032～0.320 μg and paeoniflorin and albiflorin were at 0.6～6.0 μg (r≥0.999 5); The average recoveries were 100.16%(RSD=2.7%),100.01%(RSD=1.7%),99.95%(RSD=1.5 %),99.57%(RSD=0.5%),and 99.34%(RSD=0.9%); the sample solution was stable within 24h, and the contents were 0.0436, 0.0370, 0.1557, 4.6887, 1.5245(mg/g). Conclusion:The established method for determination of atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III, Paeoniflorin, and Albiflorin was accurate and reliable, it can be used for quality control of Tongxie Yaofang.

HPLC-PDA; Tongxie Yaofang; AtractylenolideⅠ; AtractylenolideⅡ; AtractylenolideⅢ; Paeoniflorin; Albiflorin

国家自然科学基金面上项目(No.81573870)；中国博士后科学基金第八批特别资助项目(No.2015T80376)；黑龙江省自然科学基金(面上项目)(No.H2015020)；黑龙江中医药大学优秀创新人才支持计划资助(优秀青年学术带头人)(No.051217)

王艳宏(1972-)，女，博士，教授，硕士研究生导师，主要研究方向：中药制剂新技术、新剂型研究。

旺建伟*(1974-)，女，博士，教授，硕士研究生导师，主要研究方向：中药基本理论及组方配伍规律研究。

2017-01-20

修回日期：2017-02-07

R28

：A

：1002-2406(2017)05-0020-04