糖肾降浊颗粒对糖尿病肾病大鼠肾组织AGEs和转移因子β1的影响及作用机制探讨

徐孝旺，徐孝兴

(1.唐山市古冶区中医院，河北 唐山 063101；2.华北理工大学，河北 唐山 063100)

糖肾降浊颗粒对糖尿病肾病大鼠肾组织AGEs和转移因子β1的影响及作用机制探讨

徐孝旺1，徐孝兴2

(1.唐山市古冶区中医院，河北 唐山 063101；2.华北理工大学，河北 唐山 063100)

目的：探讨糖肾降浊颗粒对糖尿病肾病大鼠肾组织糖基化终产物(AGEs)及转移因子β1的影响，探讨其治疗糖尿病肾病的作用机制。方法：采用链脲佐菌素(STZ)腹腔注射制备糖尿病肾病大鼠模型，随机分为模型组、西药组、中药组，给药8周后采用免疫组化法检测各组大鼠肾组织中AGEs及TGF-β1的水平，比较血尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、尿蛋白(Pro)水平及肾组织C-反应蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量。结果：中药组肾组织中AGEs及转移因子β1明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。中药组大鼠BUN、SCr和Pro水平显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。中药组大鼠CRP、IL-6和TNF-α含量显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：糖肾降浊颗粒能够减少糖尿病肾病模型大鼠AGEs及TGF-β1表达，降低炎症反应，延缓肾脏损伤。

糖肾降浊颗粒；AGEs；TGF-β1；早期糖尿病肾病；炎症因子

糖尿病肾病发生与长期高糖状态导致体内蛋白质发生非酶糖基化反应而形成不可逆的晚期糖基化终产物(advanced glyclation end-products,AGEs)引发生物学效应，对转移因子β1的合成有直接促进作用，是糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)发病机制中最主要因素[1-3]。转移因子β1具有肾脏结构改变，加速肾脏纤维化作用[4-5]。通过免疫组织化学方法检测糖肾降浊颗粒对糖尿病肾病模型大鼠肾脏AGEs和TGF-β1、肾功能指标和炎症因子的影响，探讨糖肾降浊颗粒对糖尿病肾脏大鼠的肾脏保护作用及其作用机理。

1 材料与方法

1.1 药物

糖肾降浊颗粒组成：黄芪15 g，酒大黄10 g，丹参15 g，茵陈10 g，赤芍10 g，知母15 g，黄连10 g，干姜10 g，水蛭粉3 g;免煎颗粒(天津红日康仁堂药业有限公司，批号14021821)。贝那普利片(10 mg/片，北京诺华制药有限公司，批号20140518)。

1.2 试剂与仪器

注射链脲佐菌素(STZ，Sigma公司)；免疫组化用兔抗大鼠AGEs受体试剂盒(北京奥博生物技术有限公司)；TGF-β1(BA0290，武汉博士德生物技术有限公司)；CRP、IL-6和TGF-β1试剂盒(南京建成生物科技公司)；OLYMPUSAU5400全自动生化分析仪(日本奥林巴斯有限公司)；ELx800酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)。

1.3 动物模型建立及分组

1.3.1 模型建立

40只大鼠，体质量(200g±20)g,采用高糖高脂饲料喂养结合大鼠尾静脉一次性注射链脲佐菌素(STZ)42 mg/kg的造模方法[6]。高脂饲料配方：2.5%胆固醇，10%猪油脂，20%蔗糖，1%胆酸盐，5%蛋黄粉，61.5%基础饲料。喂养8周，分别于4、8周用代谢笼收集24 h尿液，测24 h尿蛋白定量。4周后成功制备动物模型，导致微量白蛋白尿的出现。注射STZ后72 h，测定空腹血糖≥16.7 mmol/L,为糖尿病造模成功。4周后再测尿微量白蛋白，24h尿蛋白定量≥30 mg判定为DN大鼠造模成功。造模成功共30只大鼠。

1.3.2 分组和给药

4周后，采用随机数字表法将30只糖尿病肾病模型大鼠随机分为3组，模型组10只，西药组10只，中药组10只。模型组给予生理盐水灌胃，中药组按照正常成人剂量(g/kg)的6.3倍灌胃给药。西药组给予贝那普利灌胃，给药量按照正常成人给药量等效量换算成年大鼠给药量，即0.9 mg/(kg·d)，灌胃剂量均为5 ml/kg。连续给药8周，每日1次。

1.4 检测指标

大鼠的肾组织经甲醛固定，石蜡切片，进行AGEs、TGF-β1免疫组化检测。采用免疫组织化学染色法(SABC法)检测肾组织中的AGEs、TGF-β1。显色结果以高清晰度彩色分析系统分析，在400×高倍镜下，随机选取10个不连续视野，计算平均光密度值。

大鼠眶下静脉取血2 ml，采用全自动生化分析仪测定血尿素氮(BUN)、肌酐(SC)、尿蛋白(Pro)等肾功能指标水平。

取肾组织约100 mg，PBS 缓冲液漂洗，除去血液，称重。加入10倍的PBS缓冲液研碎肾组织，制备肾组织匀浆。肾组织匀浆3 000 r/min离心15 min，取上清，-80℃保存待用。采用Elisa法检测肾组织 C-反应蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量，设3个复孔，严格按产品说明书进行操作。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠AGEs和 TGF-β1表达情况比较

中药组肾组织中AGEs及转移因子β1明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。中药组肾组织中AGEs及转移因子β1与西药组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表1。

表1 各组大鼠AGEs和 TGF-β1表达比较(平均光密度值

注：与模型组比较，aP<0.05;与西药组比较，bP>0.05。

2.2 各组大鼠肾功能指标情况比较

中药组大鼠经中药治疗后BUN、SCr和Pro水平显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。中药组BUN、SCr和Pro水平与西药组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。 结果见表2。

表2 各组大鼠BUN、SCr和Pro情况比较

注：与模型组比较，aP<0.05;与西药组比较，bP>0.05。

2.3 各组大鼠炎症因子比较

中药组大鼠CRP、IL-6和TNF-α含量显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。中药组大鼠CRP、IL-6和TNF-α含量与西药组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表3。

表3 各组大鼠炎症因子含量比较

注：与模型组比较，aP<0.05;与西药组比较,bP>0.05。

3 讨论

糖尿病肾病属中医学“消渴”“虚劳”“水肿”等范畴，早期糖尿病肾病明显的证候是“瘀证”。糖尿病肾病的主要病机是以脾肾气阴两虚为本，以血瘀阻滞为标，病变部位在络脉，血瘀为直接因素[7-12]。炎症参与糖尿病肾病发病，CRP、IL-6等炎症标志物升高，代谢紊乱与血流动力学异常是炎症持续进展关键因素[13]。本研究通过肾组织中AGEs、TGF-β1表达情况,肾功能BUN、SCr、Pro水平和CRP、IL-6和TNF-α含量的对比研究，旨在探讨糖肾降浊颗粒治疗糖尿病肾病大鼠的作用机制。

TGF-β1是纤维化的中心环节，参与成纤维细胞的活化、增生和表型转化及细胞外基质增多的过程[14];AGEs对肾脏有直接毒性作用。研究表明，糖尿病肾组织中TGF-β1上调与AGES的增加关系密切，将AGEs注入正常鼠体内，4周后发现肾小球细胞外基质和表达产物均有明显增加，AGEs可以促进肾脏合成、分泌TGF-β1[15]。

糖肾降浊颗粒中黄芪补脾益气，温运阳气，益于消渴本身血瘀阻络的治疗，仝教授[16]善用黄芪祛瘀排浊;丹参活血逐瘀;水蛭通络消瘀,血脉通畅，湿浊排泻。茵陈归脾胃，肝胆经，主要化学成分为香豆素类,香豆素有扩血管、降血脂，抗凝血作用,对实验性高胆固醇血症家兔，茵陈煎剂组较对照组的血脂明显下降，动脉壁粥样硬化减轻，内脏脂肪沉着减少，主动脉壁胆固醇含量减低[17]。知母、赤芍主治烦热消渴，大便燥结，小便不利。王好古曰：“泻肺火，滋肾水，治命门相火有余”。现代研究也表明知母有较好的降血糖作用[18]。黄连可清泄中焦胃热及诸脏之热，使热退则消谷减，火退则消渴愈，热苦能治甜，使血糖得以调整。干姜性辛，温，佐治黄连、知母过于苦寒，凉腻。“苦酸制甜”治其标，直接针对高血糖[19]。

本研究结果可见，中药组肾组织中AGEs及转移因子β1明显低于模型组，BUN、SCr和Pro水平显著低于模型组，CRP、IL-6和TNF-α含量显著低于模型组。经过糖肾降浊颗粒治疗后大鼠肾组织中AGEs及转移因子明显减少，BUN、SCr和Pro水平显著降低，CRP、IL-6和TNF-α含量显著降低。因此，可以推测糖肾降浊颗粒具有抑制DN大鼠肾脏蛋白非酶糖基化作用，使AGEs积累减少、TGF-β1的表达下调，降低肾脏组织损害，减轻炎症反应，提示糖肾降浊颗粒对肾脏具有明显的保护作用。

[1] 杜月光,高宗磊,柴可夫,等.早期糖尿病肾病“气阴两虚，络脉瘀阻”病机与AGE-RAGE轴相关性研究[J].浙江中医药大学学报,2016,40(2):75-80.

[2] 刘彩红,郭志鹏,闫峰,等.SDS-AGE在糖尿病肾损伤诊断中的应用[J].山东医药,2014,54(11):100-101.

[3] 许兆忠,王明,王艳靖,等.硝基酪氨酸对糖尿病肾病大鼠肾脏NF-κB、MCP-1及TGF-β1表达的影响[J].南方医科大学学报,2013,33(3):346-350.

[4] 刘圣,陈象青,唐丽琴,等.复方黄连胶囊对早期糖尿病肾病大鼠肾组织TGF-β1/BMP-7表达失衡及其Smad信号通路的调控作用[J].中国中药杂志,2015,40(5):938-945.

[5] 田雪,于倩,张捷,等.糖尿病大鼠肾组织中PPAR-γ对TGF-β1、c-Ski调控作用的研究[J].天津医科大学学报,2013,19(1):31-35.

[6] 郭维文,黎帅,陈玲玲,等.黄芪甲苷对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及其机制[J].中国病理生理杂志,2014,30(2):351-354.

[7] 文利,陈蕾,孙一碹,等.柚皮素通过抑制TGF-β1/smad信号传导通路缓解糖尿病肾病大鼠肾损伤[J].基础医学与临床,2016,36(7):896-901.

[8] 李凤婷,李梦,王馨瑶,等.固本通络汤对糖尿病肾病模型大鼠TGF-β1、MMP-9、TIMP-1表达的影响[J].首都医科大学学报,2014,35(1):118-121.

[9] 金丽霞,金丽军,宋立群,等.基于三焦气化理论辨治糖尿病肾病[J].中医药信息,2017,34(1):44-46.

[10] 杨文军,钱秋海.钱秋海教授采用温肾解毒化积法治疗糖尿病肾病探析[J].中医药信息,2015,32(6):56-58.

[11] 周妍,王晓婷.益气养阴化痰通络方治疗糖尿病肾病临床观察[J].中医药学报,2015,43(2):132-134.

[12] 徐艳秋,黄芳,王怡.因虚致瘀理论与糖尿病肾病[J].中医药学报,2014,42(1):7-8.

[13] 刘国玲,沈永杰,尤丽菊,等.雷公藤多苷降低糖尿病肾病大鼠炎性细胞因子的表达[J].细胞与分子免疫学杂志,2014,30(7):721-724.

[14] 冯英,胡昭,张佼佼,等.糖尿病肾病大鼠肾组织中TSP-1、TGF-β、APP、VEGF、ColⅠ的表达及意义[J].山东医药,2013,53(28):5-8.

[15] 亚莉,冯婕,姜莎莎,等.单核细胞趋化蛋白-1和转化生长因子β1及结缔组织生长因子在2型糖尿病肾病大鼠肾组织中的表达[J].中国全科医学,2013,16(21):2473-2476.

[16] 王涵.周强,仝小林,等.仝小林治疗糖尿病并发症应用黄芪经验[J].环球中医药杂志,2013,4(6):272-274.

[17] 徐孝旺.糖肾降浊颗粒治疗糖尿病肾病76例疗效观察[J].中国继续医学教育,2015,7(15):180-181.

[18] 吴莹,宋泽璧,高慧,等.知母盐制前后降血糖作用及其机制[J].中国医院药学杂志,2014,34(23):1977-1980.

[19] 吴莹,高慧,宋泽璧,等.盐知母不同有效部位改善链脲佐菌素诱导2型糖尿病大鼠糖代谢的研究[J].现代药物与临床,2016,31(3):280-283.

EffectandMechanismofTangShenJiangZhuoGranuleonAGEsandTGF-β1inDiabeticNephropathyRats

XUXiao-wang1，XUXiao-xing2

(1.GuyeDistrictHospitalofTraditionalChineseMedicine,Tangshan063101,China；2.NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063100,China)

Objective:To observe the influences of Tangshen Jiangzhuo granule on advanced glycation end products(AGEs) and transforming growth factor β1(TGF-β1) in the nephridial tissues of diabetic nephropathy(DN) rats. Methods:Streptozotocin(STZ) was used to establish the DN model in rats by intraperitoneal injection. The rats were randomized into the model group, the western medicine group, and Chinese medicine group. After eight weeks, the content of AGEs and TGF-β1 were detected by immunohistochemical method. The levels of BUN(urea nitrogen), SCr(creatinine), Pro(urine protein)in blood, as well as CRP (C- reactive protein), IL-6 and TNF-α in kidney tissues were tested. Results:The contents and levels of AGEs, TGF-β1, BUN, SCr, Pro, CRP, IL-6, and TNF-a in the Chinese medicine group were all significantly lower than those of the model group(P<0.05). Conclusion:Tangshen Jiangzhuo granule may reduce the expressions of AGEs and TGF-β1, and depress the inflammatory responses to delay kidney damages.

Tangshen Jiangzhuo granule; AGEs; TGF-β1; Early diabetic nephropathy; Inflammatory factors

河北省中医药管理局科研计划(No.2016236)

徐孝旺(1981-)，女，主治医师，主要研究方向：中西医结合内科。

2016-08-24

修回日期：2016-09-10

R285.5

：A

：1002-2406(2017)05-0034-03