小檗碱对PCOS模型大鼠子宫内膜的影响

刘逸超，付杨，郭滢，郭琦，韩凤娟

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.哈尔滨市第二医院，黑龙江 哈尔滨 150056；3.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

小檗碱对PCOS模型大鼠子宫内膜的影响

刘逸超1，2，付杨1，郭滢1，郭琦1，韩凤娟3*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.哈尔滨市第二医院，黑龙江 哈尔滨 150056；3.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：探讨小檗碱对PCOS模型大鼠血清睾酮、子宫内膜相关基因及蛋白信号的影响。方法：90日龄清洁级SD雌性大鼠根据Poretsky造模方法皮下注射胰岛素及绒毛膜促性腺激素,连续22日构建PCOS模型。小檗碱灌胃治疗28日，采用ELISA法检测睾酮激素水平，采用免疫组化法检测子宫内膜组织ERα蛋白表达情况，qRT-PCR技术检测子宫内膜Kras、PTEN mRNA基因表达水平。结果：与模型组相比，小檗碱组睾酮水平显著降低(P<0.05)；ERα阳性表达率下降(P<0.05)；Kras、PTEN mRNA表达水平下降(P<0.05)。结论：小檗碱对PCOS模型大鼠子宫内膜有显著影响，对激素合成、细胞癌变等信号分子具有调控作用。

多囊卵巢综合征；子宫内膜癌；小檗碱

多囊卵巢综合征是临床常见的生殖功能障碍与糖代谢异常并存的内分泌紊乱性疾病，由Stem和Leventhal于1935年首次提出，发病率约占育龄期妇女的10%，目前研究认为胰岛素抵抗和高雄激素血症可能是PCOS发生子宫内膜癌变的高危风险[1]。研究发现,小檗碱具有与二甲双胍相似的生物学行为，可改善胰岛素抵抗，同时具有抑制卵巢细胞分泌雄激素水平的作用[2]，因此本研究选择小檗碱作为治疗药物，进一步探讨小檗碱对PCOS模型大鼠子宫内膜病变的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

小檗碱(上海康九化工有限公司)；二甲双胍 (Sigma公司)；重组人胰岛素注射液(礼来苏州制药有限公司)；注射用人绒毛膜促性腺激素 (丽珠集团丽珠制药厂)；酶联免疫吸附试验睾酮检测试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司)；电化学发光试剂盒(Roche公司)；兔二步法检测试剂盒(中杉金桥)；ERα(Santa Cruze公司)；PCR 逆转录试剂盒(TaKaRa公司)。

1.2 实验方法

根据Poretsky法[3]建立PCOS大鼠模型，选取 90日龄 SD 雌性大鼠120只，体质量180 g左右。分笼正常饲养，正常饮食水，随机分为：1)对照组30只，每日皮下注射注射用生理盐水 0.2 ml，连续注射22日。建模后第23日起每只大鼠给予吐温-80生理盐水混合液2 ml灌胃，1次/日，连续灌胃28日。2)模型组、小檗碱组及二甲双胍组各30只，采用Poretsky法构建PCOS大鼠模型，每只皮下注射HCG 3.0 IU/d;每日皮下注射胰岛素,第1日自0.5 IU/d开始，逐渐递增至6.0 IU/d,并按此剂量维持至第22日。建模第23日起每只大鼠给予吐温-80生理盐水混合液2 ml灌胃，每日1次，连续灌胃28日。药粉均溶在吐温-80生理盐水混合液，以小檗碱200 mg/(kg·d)[4]，二甲双胍300 mg/(kg·d)[5]为灌胃浓度。

1.3 睾酮水平检测

待药物干预治疗结束，抽取眼眶静脉血离心后，检测血清T水平。酶联免疫吸附试验试剂盒检测睾酮。

1.4 ERα蛋白检测

实验大鼠断髓处死后取子宫组织，应用免疫组化检测ERα蛋白表达情况。

1.5 qRT-PCR技术检测mRNA相对表达量

各组大鼠断髓处死后取子宫内膜组织，应用qRT-PCR技术检测PTEN、Kras mRNA 在各组大鼠子宫内膜组织基因表达情况。使用SYBR Green PCR Master Mix 进行荧光定量PCR 检测。检测反应管内的荧光信号到达设定阈值所经历的循环数(Ct) ，求出基因相对内参基因β-actin表达量的变化ΔCt，即ΔCt=目的基因Ctmean-内参基因Ctmean，计算2-ΔΔCt数值进行统计比较。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠睾酮水平比较

模型组与空白组比较，睾酮分别为(339.33±66.41)、(243.04±69.08)pg/ml，差异极显著(P<0.01)。小檗碱组与模型组比较，睾酮分别为(206.14±14.63)、(339.33±66.41)pg/ml，差异极显著(P<0.01)。二甲双胍组与模型组比较，睾酮分别为(250.67±33.23)、(339.33±66.41)pg/ml，差异极显著(P<0.01)。结果见表1。

表1 各组大鼠睾酮水平比较

注：与空白组比较，*P<0.01;与模型组比较，△P<0.01。

2.2 雌激素受体α蛋白在子宫内膜的表达情况比较

模型组与空白组比较，ERα蛋白表达阳性率分别为91.67%、16.67%,差异具有统计学意义(P<0.05)。小檗碱组与模型组比较，ERα蛋白表达阳性率分别33.33%、91.67%，差异具有统计学意义(P<0.05)。二甲双胍组与模型组比较，ERα蛋白表达阳性率分别为25.00%、91.67%，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2和图1。

表2 雌激素受体α(ERα)表达[n(%)]

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05。

图1 小檗碱对PCOS模型大鼠子宫内膜ERα蛋白的影响

2.3 PCOS模型大鼠子宫内膜组织Kras mRNA、PTEN mRNA的表达情况比较

模型组与空白组比较，Kras mRNA相对表达量分别为(82.915 9±8.836 7)、(1.000 0±0.000 0),t=-20.728,P=0.000。小檗碱组与模型组比较，Kras mRNA相对表达量分别为(12.432 9±1.872 2)、(82.915 9±8.836 7),t=-17.448,P=0.000；二甲双胍组与模型组比较，Kras mRNA相对表达量分别为(1.397 0±0.406 6)、(82.915 9±8.836 7),t=-20.606,P=0.000。结果见表3，图2。

表3 各组大鼠子宫内膜组织Kras mRNA、PTEN mRNA情况比较

注：与空白组比较，*P<0.01;与模型组比较，△P<0.01。

图2 小檗碱对PCOS模型大鼠子宫内膜Kras mRNA的影响

模型组与空白组比较，PTEN mRNA相对表达量分别为(20.540 9 ±4.701 9)、(1.000 0±0.000 0),t=-9.293,P=0.000。小檗碱组与模型组比较，PTEN mRNA相对表达量分别为(0.168 6±0.264 8)、(20.540 9±4.701 9),t=-9.673,P=0.000；二甲双胍组与模型组比较，PTEN mRNA相对表达量分别为(0.529 9±0.362 6)、(20.540 9±4.701 9),t=-9.488,P=0.000。结果见表3,图3。

图3 小檗碱对PCOS模型大鼠子宫内膜PTEN mRNA的影响

3 讨论

多囊卵巢综合征患者发生子宫内膜癌变的发病率逐年升高[6-10]，研究发现子宫内膜持续受到雌激素的刺激、高胰岛素血症以及肥胖是促使形成子宫内膜癌变的重要因素[11]。Harding等研究发现,在子宫内膜癌发病的影响因素里胰岛素抵抗发挥着非常重要的作用，甚至与因接触外源性雌激素导致子宫内膜癌变的患者相比，胰岛素抵抗患者更具有发生子宫内膜癌变的高危风险[12]。Shafiee进行一项回顾性研究评估PCOS患者子宫内膜癌发病的机制，可能是通过分子级细胞调控的，胰岛素样生长因子及胰岛素样生长因子结合蛋白的功能被激活，导致胰岛素水平升高，通过激活PI3K/AKT及Ras/MAPK信号通路，加速细胞有丝分裂的作用[13]。基因组学和蛋白组学已经证实在PCOS患者子宫内膜组织里胰岛素信号传导通路影响子宫内膜癌变的基因和蛋白，其表达均上调[14]。Savaris研究也指出,过度激活PCOS子宫内膜MAPK/ERK信号传导通路，可以导致PCOS发生子宫内膜病变，而激活MAPK/ERK信号传导通路是由胰岛素抵抗和高胰岛素血症调控的[15]。

胰岛素增敏剂二甲双胍通过改善胰岛素抵抗，可以逆转子宫内膜的增生，降低PCOS发生子宫内膜癌变的风险。Engelman等研究认为,二甲双胍作为胰岛素增敏剂，通过改善胰岛素敏感性，减轻体质量，可阻止PCOS患者发展成子宫内膜癌，临床上可以显著阻止癌症细胞的癌变[16]。国内外学者已经将具有胰岛素增敏作用的二甲双胍作为治疗子宫内膜癌的参考用药。动物实验及临床试验已经证实,二甲双胍可以阻止子宫内膜增生，在使增生的子宫内膜组织恢复正常的过程中起到积极地调控作用[17]。

Hsu等通过研究发现,小檗碱可以改善AKT/PI3K信号通路，改善胰岛素信号传导，显著改善胰岛素抵抗[18]。同时小檗碱具有植物性抗癌成分，作为从植物中提取的生物碱，具有广泛的生物学活性，可以治疗多种疾病。子宫内膜病变与雌孕激素长期刺激密切相关，本研究发现小檗碱可以显著降低雌激素受体α蛋白的表达，使雌激素的生物学功能在子宫内膜局部的作用降低，减少雌激素对子宫内膜的持续刺激，降低发生癌变的风险。本实验通过检测甾体激素水平发现,小檗碱具有降低睾酮水平的作用，并且小檗碱降低雄激素睾酮的疗效优于二甲双胍。本实验为研究PCOS相关子宫内膜癌变的作用机制，选取原癌基因Kras和抑癌基因PTEN作为研究指标。小檗碱可以使PCOS模型大鼠子宫内膜组织Kras和PTEN mRNA表达均下降，与二甲双胍作用趋势是一致的。PTEN mRNA表达下降的原因可能是PTEN广泛影响细胞功能，细胞内PTEN表达降低，可能使更多的AKT蛋白发生磷酸化反应，使胰岛素信号通路发生变化，PTEN编码的蛋白具有酪氨酸磷酸化特性，可以负反馈调节与癌变相关的信号通路[19]。因此，小檗碱通过增加胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗，抑制细胞增殖，对甾体激素合成、细胞增殖、内膜癌变等信号分子具有调控作用,可以防治PCOS发生子宫内膜癌变。

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EffectofBerberineontheEndometriaofthePCOSRats

LIUYi-chao1,2,FUYang1,GUOYing1,GUOQi1,HANFeng-juan3*

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 2.TheSecondHospitalofHarbin,Harbin150056China; 3.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective:To explore the influence of Berberine on testosterone level and the expressions of endometrial gene and its protein in rats with polycystic ovarian syndrome (PCOS). Methods:120 female Sprague-Dawley rats of 90 days were made into PCOS models with 22-day subcutaneous injection of insulin and human chorionic gonadotropin(HCG). After modeling, Berberine was given to rats in the next 28 days. The testosterone levels was tested by ELISA method; the protein expression of endometrial estrogen receptor α(Era) was detected with immunohistochemical method; the expression levels of endometrial Kras and PTEN mRNA gene were detected with qRT-PCR technique. Results:Compared to the model group, the testosterone level in Berberine group was significantly decreased(P<0.05); the positive protein expression of Era, and the gene expressions of Kras and PTEN mRNA were significantly reduced in endometrial tissue(P<0.05). Conclusion: Berberine has significant effects on the endometria of PCOS rats, which regulates the hormone synthesis and cell carcinoma.

Polycystic ovary syndrome(PCOS); Endometrial carcinoma; Berberine

国家中医药管理局国家中医临床研究基地业务建设科研专项课题(No.JDZX2012038)

刘逸超(1983-)，女，黑龙江中医药大学中医妇科学专业博士研究生，主治医师，主要研究方向：中医治疗妇科疾病。

韩凤娟*(1971-)，女，主任医师，博士研究生导师，主要研究方向：妇科肿瘤。

2017-03-15

修回日期：2017-04-10

R285.5

：A

：1002-2406(2017)05-0016-04