毕赤酵母表达系统中启动元件的研究进展

蒋慧慧

（巢湖学院，安徽 巢湖 238000）

毕赤酵母表达系统中启动元件的研究进展

蒋慧慧

（巢湖学院，安徽 巢湖 238000）

毕赤酵母是真核细胞常用表达系统之一，具有细胞密度高、纯化方法简单、转录后修饰功能完善等优点。作为重要的调控元件，表达系统中启动元件的功能强弱与表达效率的高低密切相关。目前，毕赤酵母表达系统中常用的启动元件分为三类，分别是以pAOX为代表的甲醇诱导型、以pGAP为代表的非甲醇诱导型，还有一些新型工业酵母启动子也是理想的表达系统启动元件。充分了解这些酵母启动子的最新研究进展，可以为工业酵母表达系统的优化提供重要的发展思路。

毕赤酵母；启动子；诱导型；组成型

毕赤酵母（Pichia pastoris）是为数不多的商业化真核表达系统之一，自上世纪70年代Phillips Petroleum公司成功开发出P.pastoris高密度培养方案，迄今已有超过600种蛋白质成功利用这一微生物细胞工厂实现基因克隆并表达[1]。进入21世纪，P.pastoris在结构基因组学、蛋白质组学等方面也有应用[2]。毕赤酵母表达系统之所以如此受青睐，不仅因为其具有营养成分单一、细胞密度高、纯化方法简单、转录后修饰完善等优点，还与该系统中可供选择的受严密调控、功能各异的启动元件密不可分。

毕赤酵母等真核表达系统的表达效率很大程度上取决于启动元件的功能，而启动功能的强弱往往决定于它的结构和转录条件。目前，酵母等大多数真核生物启动元件所共有的结构模式已得到普遍认可，如图1所示[3]，包括上游启动子和核心启动子两部分，其中位于转录起始位点上游的TATA区与原核生物Pribnow区类似，是富含TA的保守序列[4]；TATA区的中心位置一般位于-20到-30，主要负责转录起始位点的确定；而-40到-110区的CAAT区、GC区属上游激活序列，主要控制转录起始的频率；增强子则能使连锁基因转录频率明显增加。但并不是所有真核基因的启动子区都包含上述所有保守序列，且不同基因转录条件有所差异，故不同基因来源的启动子在功能上参差不齐。

毕赤酵母表达系统中常用的启动元件可分为甲醇诱导型和非甲醇诱导型两大类，前者包括pAOX1 （alcohol oxidase，醇氧化酶）、pAOX2、pFLD1（formaldehyde dehydrogenase，甲醛脱氢酶）等，后者以pGAP（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，3-磷酸甘油醛脱氢酶）、pYPT1（GTPase酶）为代表，还有一些新型工业酵母启动子也是理想的表达系统启动元件。

图1 真核基因启动元件的结构示意图

1 甲醇诱导型启动子

1.1 pAOX1和pAOX2

当毕赤酵母以甲醇为唯一碳源时，其细胞通过特殊的甲醇利用途径进行生长[5]，途径中的醇氧化酶（AOX）和二羟丙酮合酶（DHAS）等关键酶表现出很高的水平。应用最广泛的甲醇诱导型启动子pAOX正是来源于AOX基因。毕赤酵母细胞中有两个基因能编码合成醇氧化酶，即AOX1（大于90%）和AOX2（小于10%）。一般来说，pAOX1启动子控制下的蛋白表达水平要高于pAOX2启动子，然而也有利用pAOX2启动子或截短倒位的pAOX2启动子来提高表达水平的成功报道[6]，另外通过添加消泡剂类物质如油酸，可能会提高pAOX2的转录调控水平[7]。

在成功进行了细菌、真菌、无脊椎动物、脊椎动物（包括人）、植物、病毒等多种蛋白表达的应用研究后，张震阳等[8]利用pAOX1研究甘油转运体GT2对甘油等碳源阻遏的影响，通过同源重组的方法，敲除GT2基因，获得的ΔGT2突变株可以一定程度上解除甘油对甲醇的代谢抑制，暗示甘油转运体和pAOX1的功能有关。孟祥琨[9]重点研究毕赤酵母AOX1启动子介导下毕赤酵母中ATG周围序列对基因表达的影响进行研究，结果说明在ATG周围插入的序列是通过影响了pAOX1的转录，使得mRNA的表达量发生了改变，从而影响蛋白质的最终产量。针对pAOX控制的不同表型细胞，研究者分别在培养基组成、生长动力学、连续式培养的发酵操作策略、甲醇浓度的监测与控制、辅助底物的添加等方面进行研究。另一方面，以pAOX1的分子调控机理研究为切入点，研究者希望通过启动子结构或调控路径的改造，实现非甲醇物质诱导pAOX1的起始。经过十多年的研究，目前已有多个与甲醇诱导相关的转录调节因子、跨膜蛋白等被发现，为实现启动子功能的调控提供可能。

2005年，美国俄勒冈州的Lin-Cereghino GP等[10]最早对甲醇诱导利用相关因子进行研究，实验克隆得到MXR1（methanol expression regulator 1，可编码合成甲醇代谢途径中必要的反式作用因子Mxr1p）。当细胞受到甲醇诱导时，Mxr1p由过氧化物酶体转移到细胞核，并特异性的结合在pAOX1的5’端启动子序列；在MXR1基因缺失的突变体中，pAOX1无法正常起始转录。研究人员还对Mxr1p在pAOX1转录调控区的可能结合部位进行了研究。

国内华东理工大学周祥山教授团队关于甲醇诱导型启动子碳源阻遏机制的研究较为系统和深入。2009年，宣姚吉等[11]在pAOX1启动子上游-638和-510之间发现一顺式作用调节元件D区域（Region D），该区域包含反向重复序列，参与甲醇诱导pAOX1启动子的正向调节。2010年，张平[12]在P.pastoris中克隆并分析了酿酒酵母MIG（multicopy inhibitor of GAL gene expression）同源的碳源阻遏因子编码基因PpMIG1和PpMIG2，分析结果显示，基因编码的蛋白质具有典型的C2H2锌指结构，可以与受葡萄糖等碳源阻遏的pAOX1启动子结合，从而影响转录起始。另外，通过功能鉴定，毕赤酵母己糖运载体编码基因PpHXT1受糖浓度调控，不仅影响己糖运输，其编码的蛋白质还直接参与pAOX1的阻遏途径。2011年，柏鹏[13]筛选出pAOX1葡萄糖脱阻遏毕赤酵母突变株，并依此分析出己糖感应体基因PpHXS1的缺失，使突变体在果糖、葡萄糖或甘露糖中具有pAOX1启动活性的原因；正调节甲醇诱导pAOX1起始转录的PpMPP1和PpTRM1基因也得到了功能鉴定。2012年，亓飞[14]在张平的研究基础之上，利用亚细胞定位技术，阐释了碳源阻遏因子PpMIG1和PpMIG2在不同碳源环境中对pAOX1的影响，即以甲醇为碳源时，阻遏因子位于细胞质，无阻遏现象；以葡萄糖为碳源，阻遏因子则转移至细胞核参与pAOX1阻遏调控。上述pAOX1调节因子 （正调控Mxr1p、PpMPP1、PpTRM1和负调控PpMIG1、PpMIG2）之间在表达水平上的关联也得到阐释。

1.2 pFLD1

另一类甲醇诱导型启动子pFLD1受甲醇（碳源）或甲胺（氮源）诱导：当用甲胺诱导时，葡萄糖、山梨醇或甘油可以替代甲醇作为唯一碳源；甲醇诱导时，则不可替换其他碳源。基于这一特性，可以在包含双启动子的表达系统中，通过诱导物甲醇或甲胺的切换，达到目的基因表达的灵活控制。Duan H等[15]在pPIC9K载体上加入pFLD1启动子序列，重组载体上即具有pAOX1和pFLD1双启动子，分别在pAOX1下游串联GEL（gelatin，骨胶）基因、pFLD1 下游串联 GFP（green uorescent protein，绿色荧光蛋白）基因，转化P.pastoris GS115进行后培养。当用0.5%（V/V）甲醇为碳源时，重组菌在pAOX1和pFLD1的分别起始下同时表达GEL（胞外）和GFP（胞内）；而以葡萄糖或山梨醇为碳源、甲胺为氮源时，只有GFP正常表达。为减小有机溶剂对细胞的毒性，甲胺的浓度以不超过0.5%（V/V）为宜。

pFLD1同时具有类似于pAOX1的严密调控和转录效率，这些特征使pFLD1成为甲醇依赖型启动子的可能替代对象[6]。Zhan R等[16]在毕赤酵母中首次利用pFLD1实现了IFTase（Inulin fructotransferase，菊粉果糖转移酶）的高效表达：通过四种底物的流加培养，高密度菌体受甲醇和甲胺盐酸盐共同诱导，IFTase活性最高为野生菌的3.2倍，达 62.72U/mL；1—1.5%（W/V）的葡萄糖或0.5—1.5%（V/V）甘油可以替代甲醇作为碳源，pFLD1使重组毕赤酵母无甲醇培养表达IFTase成为现实。

2 非甲醇诱导型启动子

由于甲醇在大规模生产中存在安全隐患，pAOX1等甲醇诱导型启动子的使用受到一定限制，为此非甲醇诱导的启动子研究随之展开，具体包含三类：一是组成型启动子，二是甲醇诱导启动子的改造，三是新型启动子的发现。

2.1 毕赤酵母组成型启动子

P.pastoris组成型启动子的最大优势是不需要甲醇诱导，但没有被广泛使用的原因之一可能是组成型表达的过量外源蛋白对细胞生长具有毒性[17]。在合适的条件下，含有组成型启动子的重组菌可以一直在同一碳源（葡萄糖、甘油或油酸等）条件下连续培养，其组成型表达也可以达到很高的水平。

强组成型启动子pGAP自1997年被分离出来，已成功应用于重组外消旋-果聚糖酶（LsdB）、羧酸酯酶（TCE）、哺乳动物肽转运蛋白（hPEPT1和 rPEPT2）、β-内酰胺酶、β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）、乙肝表面抗原（HBsAg）等多种不同外源蛋白的生产实验[17]。与pAOX1表达强度的对比研究中，pGAP与受甲醇诱导的pAOX1在特定蛋白的表达上各有优势：如pGAP在起始TCE的表达上优于pAOX1，而pAOX1起始的GUS表达量高于pGAP[18]。另外，国内外也有利用pAOX1和pGAP联合作用提高外源蛋白表达量的报道[19]。在碳源的选择上，pGAP较pAOX1更加宽泛，葡萄糖、甘油、油酸、甲醇等都可以被利用，但作用效果各异，其中甲醇的利用效果最差，葡萄糖和甘油效果最好，葡萄糖多用于摇瓶培养，甘油适用于大规模生产[20]。

大多数的启动子研究都以强转录活性为启动子选择依据，但研究发现在某些特殊条件下强启动子的表现不如一些弱启动子，pYPT1就是这样一类组成型弱启动子，其启动强度明显弱于pGAP，但却更适合实现最佳表达，因为强启动子带来的过量外源表达会造成细胞压力过大[21]，所以，选择最适强度的启动子是关键。秦秀林[22]采用易错PCR对pGAP进行随机突变，借助组成型表达文库筛选的高通量方法，筛选到不同强度的组成型突变启动子，组成功能性启动子文库，并分别在转录水平、蛋白和酶活水平上加以验证，为S-腺苷甲硫氨酸等代谢工程途径的优化提供了思路。

2.2 甲醇诱导启动子的改造

目前甲醇诱导启动子的改造主要有两种思路，一是借助组成型启动子的调控因子，与诱导型启动子协同作用，如Takagi S等[23]通过组成型共表达pGAP的正调节转录因子Prm1p，实现了甲醇诱导型启动子控制下的无甲醇诱导表达；二是对pAOX1进行基因结构的调整，Hartner FS等[24]通过序列调整，使pAOX1启动子可能的转录因子结合位点缺失或重复，构建了不同启动子活性（6%-160%的野生型启动子活性）的启动子文库，经过比较找出12个与甲醇诱导有关的反式作用因子，其中一些pAOX1变种启动子由于部分调控元件的改变在甲醇缺失的条件下仍具有活性。改造后的原甲醇诱导启动子，不仅摆脱了对诱导物甲醇的依赖，还在一定程度上保留了原启动子的活性。

2.3 毕赤酵母新启动子的发现

毕赤酵母新型启动子的发现研究具有多样性，有些新启动子是从毕赤酵母中筛选到的新诱导型启动子，如Cregg J等[25]研究的来源于醇脱氢酶的新诱导型启动子pADH1，不论是在以甘油为主要碳源的培养基中添加乙醇，还是直接以乙醇为唯一碳源，启动子都受到严格的诱导调控；Stadlmayr G等[26]通过对毕赤酵母转录水平较高的基因进行分析，发现硫胺素合成基因启动子pTHI11在低特异性生长速率下没有高转录水平，但在添加硫胺素的生长培养基中转录活性明显提高，是新型硫胺素诱导启动子。亓飞等[27]使用RNA-Seq技术，测序了毕赤酵母的转录组，并从中筛选到2个新型强启动子P437和P1431，其中P437仅受甲醇诱导而受葡萄糖阻遏，P1431在甲醇和葡萄糖碳源中均可驱动外源蛋白表达，并且葡萄糖对其诱导作用更强。张雪[28]从毕赤酵母鼠李糖代谢途径中挖掘了两个鼠李糖诱导型启动子P0075和P0341，均可有效启动报告基因lacB和gfp的表达。

另一部分新启动子是基于高转录水平筛选到的组成型启动子，如张轩薇等[29]研究的细胞壁蛋白基因启动子pGCW14，在南极假丝酵母脂肪酶 B（CALB）的表达实验中，pGCW14的活力高于pGAP、接近pAOX1，且具有最高的产酶效率；研究者还利用在线分析软件TESS对pGCW14的可能作用元件进行了预测，并尝试利用启动子序列突变提高启动子活性。

3 新型工业酵母启动子

在工业毕赤酵母表达系统中，还有一些工业酵母来源启动子由于其特殊性质 （如耐高温、耐高渗），在启动子的结构研究和应用中也占有十分重要的位置。

3.1 耐高温新启动子

耐热酵母Pichia thermomethanolica（后命名为Ogataea thermomethanolica）可以在高温下以甲醇为唯一碳源生长[30]，2012年该酵母已成功用做P.pastoris启动子的表达宿主，且转化效率很高。为提高P.thermomethanolica在大规模工业生产中作为外源蛋白表达宿主的能力，研究者对该酵母自身的潜在可利用启动子展开研究。Harnpicharnchai P 等[30]从 P.thermomethanolica BCC16875中分离出耐高温的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子ptGAP，该启动子除具有毕赤酵母pGAP的强组成型表达特性，还可以在高达42℃的多种碳源环境中有效起始转录，降低工业化生产的冷却成本。Promdonkoy P等[31]还对来自于该株耐热酵母的醇氧化酶基因启动子pOthAOX进行了研究，pOthAOX是耐高温的甲醇诱导型启动子，可以在最高45℃温度下调控植酸酶的表达；且pOthAOX是唯一发现的、在去阻遏阶段起始外源蛋白表达的AOX启动子。

3.2 耐高渗新启动子

产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）是一株从自然界筛选得到的工业甘油生产菌株，具有耐受高渗透压、高产甘油的特点[32]。通过对酵母高渗甘油应答途径（HOG途径）的分析，多个甘油合成途径中的关键酶基因启动子被克隆和分析，如pCggpd（胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子）和pCgSTL3（H+/甘油转运蛋白基因启动子）。丁春生[33]和刘爱玲[34]分别在酿酒酵母、烟草中分析了pCggpd受渗透压调控的特性，刘爱玲还结合启动子上游存在的七个渗透压胁迫应答元件（STRE），设计了不同长度启动子片段，通过报告基因找到1000bp的最强调控启动子片段。徐丹[35]以pUC19为改造对象，利用pCggpd替换原有启动子，结合其18s rDNA为整合位点，构建了适用于工业菌株的穿梭型整合载体pUSGZ。朱佳莉[36]筛选到受HOG途径核心分子CgHog1调控的启动子 pCgSTL1、pCgSTL3、pCgZWF，并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对三种启动子受不同渗透压调节的启动强度进行比较，结果显示在一定范围内随着渗透压的变化，三种启动子的启动强度也随之进行调整，其中pCgSTL3受渗透压调控作用最强。

4 结论与展望

毕赤酵母表达系统一直是分子生物学的研究热点，其中核心启动子由于其特殊性能尤其受到关注。本文主要分三部分介绍毕赤酵母表达系统中常用的启动元件，即甲醇诱导型、非甲醇诱导型和新型工业酵母启动子。这三类启动子特征显著，培养要求各异，可以满足毕赤酵母表达系统中各类外源蛋白的表达需求。结合全面的启动性能分析、诱导机制调控和启动强度可调的新启动子筛选，适合毕赤酵母表达系统的启动元件库正逐步丰富，发现、掌握、改造这些酵母启动子的作用及应用特点，可以为构建最优化工业酵母表达系统提供参考。

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RESEARCH PROGRESS OF PROMOTER ELEMENTS IN PICHIA PASTORIS EXPRESSION SYSTEM

JIANG Hui-hui
（Chaohu College， Chaohu Anhui 238000）

Pichia pastoris is one of the most common expression systems for eukaryotic cells,with the advantages of high cell density,simple purification methods,and the perfect function of post-transcriptional modification.As an important regulatory element,the function of the promoter element in the expression system is closely related to the level of expression efficiency.At present,the promoter elements commonly used in Pichia pastoris expression system are divided into three types:the methanol inducible promoter represented by pAOX,non-methanol inducible promoter like pGAP,and some new industrial yeast promoters are also ideal promoter elements.To fully understand the latest research progress of these yeast promoters could provide an important development idea for the optimization of industrial yeast expression system.

Pichia pastoris； Promoter element； Inducible promoter； Constitutive promoter

Q939.5

A

：1672-2868（2017）03-0067-06

责任编辑：李 晓

2017-04-06

蒋慧慧（1988-），女，安徽合肥人。巢湖学院化学与材料工程学院，助教。研究方向：分子生物学。