多药耐药性肿瘤动物模型的评价

刘俊勇(综述)，彭　芳(审校)

(大理学院药学与化学学院，云南 大理 671000)



多药耐药性肿瘤动物模型的评价

刘俊勇△(综述)，彭芳※(审校)

(大理学院药学与化学学院，云南 大理 671000)

摘要：多药耐药性(MDR)肿瘤动物模型是攻克肿瘤耐药性的基础，同时在逆转肿瘤耐药性的药物筛选研究中也起重要作用，因此，优越的MDR肿瘤动物模型在科学研究中具有很高的应用价值。目前，MDR肿瘤动物模型主要通过移植、诱导和体内外联合诱导3种方法构建。该文通过对MDR肿瘤动物模型资料进行归纳和总结，对这3种方法进行了详细的表述和评价，并对MDR肿瘤动物模型的评价方法进行了简要的叙述。

关键词：肿瘤；耐药；动物模型；移植型；诱导型；评价方法

多药耐药性(multiple drug resistance，MDR) 最早是由Biedler和Riehm[1]提出，其是指在恶性肿瘤的治疗过程中，由于肿瘤复发，再次使用曾经使用过的有效的抗癌药物或改用其他从未使用过的抗癌药物而变得无治疗作用的现象[2-3]。化疗药物耐药的确切性质和潜在作用是否与参与运输的抗癌药物抗性基因有关尚不清楚[4]。MDR的出现与化疗药物在肿瘤细胞内的浓度达不到有效作用浓度有关，药物的外排可能是耐药产生的一个重要原因[5]。膜转运蛋白ABC (adenosine triphosphate-binding cassette)家族的过度表达与肿瘤耐药性的形成也密切相关。与MDR有关的ABC家族成员有48个，其中P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白家族 (MDR-related protein，MRPs)以及乳腺癌耐药相关蛋白 (breast cancer resistance-related protein，BCRP)最为重要。另外，一些膜转运蛋白也与肿瘤MDR的产生相关[6]。

MDR肿瘤动物模型的建立对肿瘤MDR的基础研究、药物评价以及MDR逆转研究等起重要作用。现对现阶段MDR肿瘤动物模型的建立方法及其特点进行评价，旨为建立优越的MDR肿瘤动物模型、提高模型建立成功率及逆转肿瘤MDR等提供参考。

1常用的MDR肿瘤动物模型

移植型和诱导型是建立MDR肿瘤动物模型的两种常规方法[7-8]，由于这两种方法建立的模型又存在各自的缺点，因此研究人员又通过体内联合体外诱导建立了一种新的方法[9]。

1.1移植型MDR肿瘤动物模型移植型又分为细胞株移植型和组织原位移植型。

1.1.1细胞株移植型MDR肿瘤动物模型是把现有的肿瘤耐药细胞或在体外诱导产生的肿瘤耐药细胞接种到裸鼠皮下，在肿瘤形成后对模型进行评价指标的检测[10]。细胞株移植建立的动物模型具有操作简单，创伤小，耐药稳定，易于重复，肿瘤表浅易于观察，宿主生长情况一致，个体差异小等优点。该方法也可在同种或同品系动物间连续移植，实验周期较短，经过多年研究，成瘤率较早期有所提高。虽然细胞株移植建立的动物模型有诸多优点，但有研究发现，用于移植的耐药细胞耐药指数越高，在动物上的致瘤率越低[11]。因此，应用该方法建立高耐药指数的动物模型仍需进一步研究。同时，部分移植瘤在动物体内出现肿瘤生长速度过快、增殖比率高、体积倍增时间短等与人体肿瘤显著不同的现象，因此其在模拟人体环境方面仍需进一步研究。

1.1.2组织原位移植型MDR肿瘤动物模型是在动物体内原位植入组织学完整的原发性多药耐药人肿瘤组织，从而建立MDR肿瘤动物模型，然后再对模型的各项指标进行检测[12]。该方法以肿瘤组织为材料，建立的动物模型保留了瘤源组织的MDR和病理生理特点，其不仅能从细胞水平反映出真实的MDR范围和程度，而且能从组织层面反映耐药肿瘤细胞间、耐药肿瘤细胞与基质细胞间的相互作用对MDR的影响，最重要的是该方法突破了细胞移植型模型缺乏内环境的问题，这使患者的肿瘤在活体上再现成为可能，并可根据模型的反应指导患者化疗。但该方法操作复杂，对动物创伤较大，肿瘤生长不便于观察，因而在现实中的应用受到限制。刘艳红等[13]采用在兔皮下接种和肝原位移植VX2肿瘤组织块两种方法建立模型，结果显示两种方法建立的动物模型的耐药性无明显差异。因此，该方法已较少应用于实验研究中。

1.2诱导型MDR肿瘤动物模型不同的诱导剂、不同的诱导剂剂量、不同的诱导方式以及不同动物所建立的模型也存在明显区别。

1.2.1阿霉素诱导的MDR肿瘤裸鼠模型其是模仿肿瘤MDR在体内的形成过程，通过给予不同剂量(或不同给药方式)的阿霉素而建立的肿瘤MDR裸鼠模型，同样运用与移植法相同的耐药性检测方法和耐药标志物进行检测。阿霉素是最常用的MDR诱导剂，不同给药剂量或给药方式可以产生不同的耐药动物模型。持续小剂量给药建立的继发性MDR肿瘤裸鼠模型成瘤时间短，成瘤率高，肿瘤生长好，有近似人体的MDR形成过程和生物学特性[14]。通过间歇腹腔注射阿霉素诱导建立的MDR肿瘤裸鼠模型能保证裸鼠长时间生存，其可在较短时间内诱导出耐药性，诱导简洁，也能很好地模拟人肿瘤MDR的形成过程[15]。

1.2.2阿霉素诱导S180荷瘤小鼠该方法是反复应用低剂量阿霉素对S180荷瘤小鼠进行皮下注射，诱导模型建立后可应用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]法、流式细胞术、聚合酶链反应等方法进行耐药性和耐药标志物的检测[16]。该方法克服了以往应用化疗方案进行诱导时，S180荷瘤小鼠死亡率高及模型一致性低的缺点，但该方法建立的模型耐药倍数相对较低，因此不适合建立高耐药性模型。

1.2.3紫杉醇诱导的MDR肿瘤裸鼠模型给敏感性荷瘤裸鼠腹腔注射一定剂量的紫杉醇，24 h后取出瘤块传代于子代裸鼠，重复给药诱导与传代，P-糖蛋白蛋白的表达确定耐药性的形成[17]。该方法虽然能成功建立肿瘤耐药动物模型，但操作较为复杂且要求严格。因此，无具体要求一般不应用该方法建立模型。

1.2.4联合化疗PFC (紫杉醇+氟尿嘧啶+顺铂) 方案诱导的S180腹水型小鼠该方法是应用化疗PFC方案诱导建立S180腹水型小鼠，经过一系列培养传代，采用免疫组织化学法和流式细胞术测定其耐药性和耐药标志物[18]。该方法符合人体耐药产生的机制，实验也相对简单，但由于多种药物共同作用，相对来说影响因素较多，不易获取相对一致的结果，但可针对现存化疗方案耐药性的产生机制进行研究。

1.2.5联合化疗诱导615荷瘤小鼠应用5-氟尿嘧啶和阿霉素诱导615荷瘤小鼠，采用MTT法分析耐药敏感性及耐药指数，逆转录-聚合酶链反应检测耐药基因，流式细胞术检测耐药蛋白外排功能[19]。与其他方法相比，615小鼠成瘤率高，存活时间长，可达到3个月，便于成模后进行更长时间的操作，对于一些需要长时间给药的实验来说是较为理想的模型。

1.3体内外联合诱导型MDR肿瘤裸鼠模型体内外诱导联合型MDR肿瘤裸鼠模型是将耐药肿瘤细胞接种到裸鼠皮下，成瘤后再进行药物诱导耐药建立MDR肿瘤动物模型，运用MTT法检测耐药指数，免疫组织化学检测多药耐药蛋白的变化[20]。该方法是现阶段较为可靠的MDR肿瘤动物模型的建立方法，这种方法既克服了移植方法建立的动物模型的耐药性丢失，也克服了诱导方法的诱导时间长、操作复杂等缺点，同时该模型稳定性及重复性强，可广泛用于各种需要耐药模型的实验中。

总体来说，细胞移植型模型简单易行，实验周期短，可进行不同程度的耐药细胞株的同时移植，但其耐药性不稳定，易丢失，且缺乏内环境；组织原位移植操作难度大，对动物的创伤大，同样也存在耐药性不稳定等缺点；诱导型模型虽然是能客观反映人体产生耐药的过程，且更符合人体内形成MDR的机制和生物学特征，但是该方法较为费时费力，且受荷瘤动物生存时间的限制；体内外联合诱导型动物模型综合了移植型和诱导型的优点，又克服了以上两种模型的不足，是较为理想的肿瘤模型，但关于该模型研究的信息还很少，是否存在不足还需要进一步研究。

2MDR肿瘤动物模型的评价方法

动物模型需要进行有效性评定，由评定结果确定模型建立是否成功[21]。检测动物模型耐药性的具体指标如下。

2.1肿瘤生长状态记录肿瘤出现时间，同时在出瘤后每隔4 d用游标卡尺测量肿瘤的长径(A)和短径(B)，通过公式V=4/3π×A×B2计算肿瘤体积，并绘制生长曲线。通过比较耐药组动物模型与对照组动物模型的肿瘤生长状况，明确肿瘤生长与耐药性的诱导是否存在显著差异[22]。同时，成瘤率也是MDR肿瘤动物模型的一个重要指标，其能充分反映模型建立的可行性。

2.2模型动物的生长状况建立的MDR肿瘤动物模型要确保动物在造模后存活时间足够长，生长状况良好，无饮水及进食不正常等情况出现，以便对成模后的动物进行进一步研究[23]。

2.3耐药倍数检测使用某种化疗药物建立的肿瘤MDR模型一般需要选用同种、同类别甚至是不同类别的其他化疗药物检测其敏感性，以衡量耐药性。而耐药性一般用耐药倍数表示，常采用MTT法、磺酰罗丹明B比色法和Patterson细胞群体倍增时间法进行检测，还可通过显微镜观察细胞的形态及超微结构、活细胞染色技术绘制生长曲线计算细胞倍增时间来表示耐药倍数[24-26]。

2.4耐药标志物的检测多药耐药蛋白和恶性功能标志分子是常用的耐药标志物。多药耐药模型一般都存在耐药标志物的过表达现象。现阶段最常用的耐药标志物有耐药蛋白P-糖蛋白、BCRP、多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance associated protein 1，MRP1)等。主要的检测方法有荧光法检测蛋白底物外排的累积，聚合酶链反应或逆转录-聚合酶链反应法检测耐药基因的表达，流式细胞术和蛋白质印迹法检测蛋白的表达[27-29]。

2.5耐药机制的检测常用的耐药机制检测包括P-糖蛋白上调机制、细胞因子异常、凋亡通路失敏、周期调控紊乱等，它们在耐药肿瘤与敏感肿瘤中的表达或功能存在明显的差异，其中P-糖蛋白上调机制是最常用的耐药机制检测[30]。此外，随着科技的发展，一些新技术也开始用于耐药机制的研究。唐三元[31]采用电泳和质谱进行蛋白质组学鉴定发现，耐药鼻咽癌细胞与其亲本细胞的表达谱存在显著不同；肿瘤干细胞也已被证实与肿瘤的耐药性密切相关[32]。

3MDR肿瘤动物模型的展望

临床上，肿瘤化疗产生的MDR问题仍然突出，国内外学者也越来越重视解决肿瘤MDR的问题[33]。MDR的逆转在临床上具有重要价值，目前对于此方面的研究也取得了较为丰硕的成果[34]，但常常由于其不良反应或操作问题而难以应用于临床，这些问题仍然需要在良好的MDR肿瘤动物模型的基础上进行研究。

4结语

现阶段，肿瘤MDR的体外模型研究较多，但体外模型缺少内环境作基础，说服力不强，而动物模型能充分反映耐药性形成的复杂机制。由于形成MDR的因素较多，而各种因素又不是独立存在的，往往相互关联，共同促使MDR的产生和维持[35-36]，因此，通过单一因素建立的MDR肿瘤模型很难模拟出真实的MDR，此外，动物模型要在提高成瘤率、缩短建模时间、控制耐药程度以及耐药稳定性等方面寻找突破，以优化动物模型。优越的MDR肿瘤动物模型，不仅在肿瘤耐药性形成机制方面有重要作用，在逆转MDR的研究以及药物评价方面也具有非常重要的价值。

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Evaluation of Tumor Multidrug Resistance Animal ModelsLIUJun-yong,PENGFang.(CollegeofPharmacyandChemistry,DaliUniversity,Dali671000,China)

Abstract:Multidrug resistant(MDR) tumor animal model is fundamental to overcome tumor resistance,which also plays a crucial role in the drug screening study about effectively reversing drug resistance in a variety of tumors,therefore,the value of superior MDR animal model is even more prominent in scientific research.So far,transplantation,induction and combination of in vitro and in vivo induction,are three methods to build the MDR tumor animal models.Here is to summarize the data about MDR tumor animal models,and the three methods are described and evaluated in detail,the evaluation method of MDR tumor animal models is briefly described as well.

Key words:Tumor; Resistance; Animal model; Transplantation; Induction; Evaluation method

收稿日期：2014-10-04修回日期：2015-03-15编辑：辛欣

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.21.022

中图分类号：R752.11

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)21-3905-04