罗红霉素对小鼠乙酰胆碱预收缩气管环的舒张作用

于孟飞，王倩，刘松青，沈金花，刘庆华(中南民族大学生命科学学院，武汉430074)



罗红霉素对小鼠乙酰胆碱预收缩气管环的舒张作用

于孟飞，王倩，刘松青，沈金花，刘庆华
(中南民族大学生命科学学院，武汉430074)

目的 观察罗红霉素对小鼠气管环的舒张作用，并探讨其作用机制。方法 取BALB/c小鼠15只，处死后分离气管环，将气管环置于灌流槽中，经过高钙液平衡后开始实验。使用激动剂乙酰胆碱(Ach)100 μmol/L收缩气管环，待气管环张力达到平台期后,分别加入终浓度为10-2、10-1.5、10-1、10-0.5、100、100.5、100.75、101mg/mL的罗红霉素，观察不同浓度罗红霉素作用下的气管环肌张力和舒张比率，将引起气管环最大舒张的最低药物浓度100.75mg/mL作为罗红霉素最佳药物浓度。向灌流槽中加入100 μmol/L Ach预收缩气管环，随后加入L型钙离子通道抑制剂硝苯地平、非选择性阳离子通道抑制剂吡唑盐3(Pyr3)，待抑制剂舒张气管作用达到平台期后，加入100.75mg/mL罗红霉素，观察气管环的肌张力变化和舒张比率。结果 Ach预收缩的气管环的肌张力为(7.03±0.35)mN，加入最佳浓度的罗红霉素后，肌张力降至(3.47±0.29)mN(P<0.05)。加入硝苯地平、Pyr3后气管环的肌张力降低，舒张比率增加(P均<0.05)；继续加入罗红霉素后，气管环的肌张力继续降低，舒张比率较前升高(P均<0.05)。结论 罗红霉素对小鼠Ach预收缩的气管环具有舒张作用，并可增强硝苯地平、Pyr3对于Ach预收缩气管环的舒张作用，其主要通过调控钙离子通道来发挥作用。

气管环；乙酰胆碱；罗红霉素；钙离子通道；气管舒张；哮喘

哮喘是由嗜酸粒细胞、淋巴细胞等多种炎性细胞参与的慢性气道炎症，其发病机制与以支气管平滑肌收缩为主的过敏反应有关，其气道阻塞是可逆的[1]。哮喘发作时，乙酰胆碱能神经兴奋可引起乙酰胆碱(Ach)大量释放，并导致气管平滑肌细胞膜上的钙离子通道(主要是L型钙离子通道和非选择性阳离子通道)的开放，引起Ca2+内流、气管收缩和气管腔缩窄，造成呼吸困难。研究显示，L型钙离子通道特异性抑制剂硝苯地平可以有效缓解哮喘患者的症状[2]，非选择性阳离子通道抑制剂Pyr3对气管环也具有舒张作用，对哮喘具有一定的治疗效果[3]。罗红霉素作为一种抗炎药物，常用于单独或联合其他药物(如沙丁胺醇)治疗哮喘[4～10]，来缓解咳嗽等相关症状。近期研究发现，苦物质对气管具有强烈的舒张作用，具有开发成为治疗药物的潜力[11]。罗红霉素作为一种苦物质，除了具有消炎作用之外，是否可以对气管发挥舒张作用，从而实现对哮喘的治疗尚无定论。2016年2～6月，我们以Ach作为气管环收缩的激动剂，观察罗红霉素对气管环的舒张作用，并观察罗红霉素对L型钙离子通道抑制剂硝苯地平、非选择性阳离子通道抑制剂吡唑盐3(Pyr3)舒张气管作用的影响，探讨罗红霉素治疗哮喘的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 8～10周龄SPF级BALB/c小鼠，购于湖北省实验动物中心。自由饮水、进食，每周更换垫料。罗红霉素分散片(江苏黄河药业)，氯化钠、氯化钾、六水氯化镁、盐酸、氢氧化钠、葡萄糖等购于国药集团化学试剂有限公司。无水氯化钙购于天津科密欧化学试剂有限公司。HEPES、Ach、硝苯地平、Pyr3、二甲基亚砜(DMSO)购于美国Sigma公司。高钙液(PSS)的配制：135 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，2 mmol/L CaCl2，10 mmol/L HEPES，10 mmol/L葡萄糖注射液(pH=7.4)。硝苯地平、Pyr3溶于DMSO制成100×母液，-80 ℃保存备用。将罗红霉素分散片碾碎并溶解于PSS中，制成56.2 mg/mL的罗红霉素母液。

1.2 气管环的制备 静脉注射戊巴比妥钠150 mg/kg处死小鼠，剪下气管，去除附着组织，剪成3～4 mm长的气管环。将气管环套入张力换能器的三角形挂钩中，挂钩上端连接张力换能器，下端固定于氧气出口上方的挂钩上，浸泡于通氧的37 ℃的PSS灌流槽中。将气管环前负荷设置为0.3 g。每15 min更换PSS一次，共换液4次，完成预平衡。用100 μmol/L Ach对气管环进行预刺激，待张力达到平台期后，以PSS洗脱Ach，等气管环张力达到基线，完成1次预刺激。预刺激3次后开始正式实验。

1.3 罗红霉素最佳药物浓度的确定 向灌流槽中加入不同体积的罗红霉素母液，使灌流槽中的罗红霉素浓度依次达到10-2、10-1.5、10-1、10-0.5、100、100.5、100.75、101mg/mL，在药物作用达到平台期时，读取张力换能器显示的张力数值。实验结束后，将气管环置于56 ℃烘箱中烘干12 h，然后称取干重(mg)。气管环的瞬间肌张力(mN)=(瞬间张力值-300)mg/气管环干重(mg)。罗红霉素对气管环的舒张比率=(未加罗红霉素时平台期肌张力-添加某一浓度罗红霉素后平台期肌张力)/未加药物时肌张力×100%。比较不同浓度罗红霉素对气管环的舒张比率，将引起气管环最大舒张的最低药物浓度100.75mg/mL作为罗红霉素的最佳浓度。

1.4 罗红霉素对硝苯地平舒张气管环作用影响的观察 气管环经平衡和预刺激后，向灌流槽中加入100 μmol/L Ach，刺激气管环使其收缩达到最大值，并进入平台期，读取张力换能器显示的肌张力数值。然后加入10 μmol/L硝苯地平舒张气管环。待舒张作用达到稳定后，读取肌张力数值。最后，加入100.75mg/mL罗红霉素，读取肌张力数值。

1.5 罗红霉素对Pyr3舒张气管环作用影响的观察 气管环经平衡和预刺激后，向灌流槽中加入100 μmol/L Ach，刺激气管环使其收缩达到最大值，并进入平台期，读取肌张力数值。然后，加入30 μmol/L Pyr3舒张气管环，待舒张作用达到稳定后，读取肌张力数值。最后，加入100.75mg/mL罗红霉素，读取肌张力数值。

2 结果

2.1 罗红霉素对Ach预收缩气管环的舒张作用 不同浓度罗红霉素对Ach预收缩的气管环肌张力、舒张比率的影响见表1。100.75mg/mL罗红霉素作用后的气管环舒张比率最高，为最佳药物浓度。见表1。

2.2 罗红霉素对硝苯地平舒张气管环作用的影响 加入硝苯地平前，气管环的肌张力为(8.61±0.42)mN，舒张比率为0；加入硝苯地平后，肌张力降至(7.31±0.34)mN，舒张比率增加至15.1%±4.9%(P均<0.05)；继续加入罗红霉素后，肌张力降至(5.22±0.51)mN，舒张比率增加至39.4%±5.9%(P均<0.05)。

表1 不同浓度罗红霉素对Ach预收缩的气管环的舒张作用

2.3 罗红霉素对Pyr3舒张气管环作用的影响 加入Pyr3前，气管环的肌张力为(7.63±0.72)mN,舒张比率为0；加入Pyr3后，肌张力降至(5.40±0.71)mN，舒张比率增加至29.2%±9.3%(P均<0.05)；继续加入罗红霉素后，肌张力降至(3.54±0.53)mN，舒张比率增加至53.6%±6.9%(P均<0.05)。

3 讨论

哮喘是由多种细胞及细胞组分参与的慢性气道炎症，常伴随气道反应性增高、气道平滑肌收缩力增强，导致反复发作的喘息、气促、胸闷和(或)咳嗽等症状，此类症状常伴有广泛而多变的气流阻塞，能够自行或通过药物干预治疗而逆转。糖皮质激素是目前治疗哮喘应用最广泛的药物，但长期服用可引起肌肉无力、消化性溃疡、水钠潴留、高脂血症等不良反应，导致其临床应用受限。因此，寻找和开发治疗哮喘的新药从而进一步缓解哮喘，成为重要的研究课题。

哮喘发作时，主要是胆碱能神经兴奋，促使Ach大量释放。随后Ach通过与平滑肌细胞膜上的特异性受体结合，激活L型钙离子通道和细胞膜上的G蛋白；然后激活下游的磷脂酶C、三磷酸肌醇和二酰甘油，引起肌细胞内Ca2+浓度升高；最后激活肌球蛋白轻链蛋白的磷酸化，从而触发肌细胞收缩。硝苯地平作为L型钙离子通道阻断剂，可以有效阻止气管平滑肌细胞Ca2+通道开放，导致Ca2+内流减少、气管舒张。Ach在引起气管环收缩的过程中，可以同时激活L型钙离子通道和非选择性阳离子通道[13]。因此，L型钙离子通道抑制剂硝苯地平、非选择性阳离子通道抑制剂Pyr3可被用来缓解哮喘症状。然而，这两种药物在临床治疗哮喘过程中仍存在一些问题亟待进一步阐明。其治疗哮喘的分子作用机制仍有待深入研究。

近期研究发现，苦物质具有舒张气管的作用。罗红霉素作为一种苦物质，是否可以通过舒张气管从而治疗哮喘尚不明确。此外，罗红霉素是十四元环大环内酯类抗生素，是红霉素的衍生物，可以通过纠正Th1/Th2细胞因子失衡，发挥抑制炎症作用，临床常用其治疗敏感菌、支原体、衣原体等感染后引起的呼吸道感染和哮喘等疾病[5，6]。但单纯抗炎治疗并不能根治哮喘，不能完全消除部分哮喘患者的气道高反应性，即气管平滑肌收缩力增强和敏感性升高的现象。鉴于罗红霉素已被临床证明具有安全、高效和廉价等优点，因此罗红霉素具备作为解痉剂来治疗哮喘的潜力。本研究结果显示，在硝苯地平或者Pyr3存在的条件下，罗红霉素能够将气管环的肌张力由(7.31±0.34)mN和(5.40±0.71)mN分别降低至(5.22±0.51)mN和(3.54±0.53)mN,舒张比率分别达到39.4%±5.9%和53.6%±6.9%。表明硝苯地平与罗红霉素联合作用可以使Ach预收缩气管环发生部分舒张，Pyr3与罗红霉素联合作用也可以使Ach预收缩的气管环发生部分舒张，推测罗红霉素可通过增强L型钙离子通道抑制剂、非选择性阳离子通道抑制剂，发挥促进Ach预收缩的气管环舒张的作用，提示罗红霉素与硝苯地平或Pyr3联用可以更好地控制哮喘[12]。

综上所述，罗红霉素可以增强L型钙离子通道抑制剂硝苯地平及非选择性阳离子通道抑制剂Pyr3对Ach预收缩气管环的舒张作用，其机制可能与抑制L型钙离子通道和非选择性阳离子通道有关。

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国家自然科学基金面上项目(31571200)。

刘庆华(E-mail: 2011093@mail.scuec.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.011

Q253; Q28

A

1002-266X(2017)26-0038-03

2017-01-22)