阿尔茨海默病样三重转基因小鼠血小板的功能改变及机制探讨

刘远新,刘 涛

(西安体育学院健康科学系，西安 710068)

阿尔茨海默病样三重转基因小鼠血小板的功能改变及机制探讨

刘远新,刘 涛

(西安体育学院健康科学系，西安 710068)

目的 探讨常见的阿尔茨海默病(AD)小鼠模型APP/PS-1/tau(3xTg)小鼠血小板功能变化情况及机制分析。方法 实验小鼠分为3xTg-AD组和WT组；采用流式细胞术和粘附试验等方法评价3xTg-AD和WT小鼠血小板的功能；并采用Western blotting方法对其机制进行探讨。结果 老年3xTg-AD小鼠血小板计数和糖蛋白表达与对照WT小鼠差异无统计学意义 (P>0.05)。但是与对照WT小鼠相比，3xTg-AD小鼠血小板与纤维蛋白原的粘附能力增强(P<0.05)。此外，与纤维蛋白原粘附功能增强的3xTg-AD小鼠血小板信号蛋白的磷酸化也增加，包括PI3激酶Akt和p38MAP激酶(P<0.05)。然而，两组小鼠中由激动剂诱导的活化血小板无统计学差异(P>0.05)。结论 3xTg-AD小鼠循环血液中血小板粘附功能增加，可能与AD疾病的进展相关。

三重转基因小鼠; 阿尔茨海默病; 血小板功能

在外周血细胞中，在止血与血栓形成中发挥重要作用的血小板，最有可能与血管疾病和AD有联系[4]。与同龄健康者比较，AD患者血小板形态及淀粉样前体蛋白 (amyloid precursor protein, APP)代谢异常，特别是APP比值明显降低[5]。此外，AD患者血小板在一般情况下处于高活化状态，受到刺激后P-选择素高表达，整合素αIIbβ3激活，以及高水平的血小板/白细胞聚集[6]。血小板活化也在APP23小鼠AD模型中观察到，老年APP23小鼠血小板整合素活化增强，激活的血小板可导致血管炎症和血栓形成[7]。研究发现，3xTg-AD小鼠血小板APP减少，这是AD患者血小板常出现的状况[8]。此外，3xTg-AD小鼠脑血管中Aβ、凝血酶、肿瘤坏死因子α，白细胞介素1和6等过表达[9]。然而，3xTg-AD小鼠血小板功能变化未被报道。因而，本研究旨在比较老年3xTg-AD和野生型(WT)小鼠血小板粘附及活化状态。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

清洁级C57BL/6 小鼠购于购于西安交通大学医学部【SCXK(陕)2007-003】；APP/PS1/Tau 三重转基因(3xTg)小鼠购于上海斯莱克实验动物有限公司【SCXK(沪)2012-0002】，鼠龄为18个月。实验动物分为两组，3xTg-AD组和正常对照(WT)组。

1.2 实验仪器及试剂

流式细胞仪(美国BD公司)；荧光显微镜(日本奥林巴斯)；凝血酶受体活化肽(TRAP4)、 convulxin (CVX)和U46619(美国Sigma公司); 糖蛋白VI、CD42b、CD41和CD49b 抗体(美国Biolegend公司)；TRITC标记鬼笔环肽(美国Sigma公司); P-Akt、P-p38和β-actin抗体(美国CST公司)。

1.3 血小板制备

从麻醉小鼠的腹腔静脉采集血液，注射器中含有3.8%枸橼酸钠做为抗凝剂。血液用HEPES缓冲液稀释后180 r/min离心10 min，获得血小板丰富的血浆(PRP)。再加入0.02 U/mL磷酸酶和1 μmol/L PGE1后，离心10 min (550 r/min)。去除上清液后，用PIPES缓冲液洗涤血小板颗粒后离心15 min (720 r/min)。然后制备的血小板悬浮在HEPES缓冲液中(5 × 108/mL)。

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1.4 流式细胞分析

制备好的血小板样品(在0.05 mL HEPES缓冲液中含有106细胞)，未经处理或0.5 mmol/L TRAP4、50 ng/mL convulxin和5 μmol/L U46619刺激的血小板，在室温下与 FITC标记的纤维蛋白原反应30 min。采用特异性抗体检测WT和3xTg-AD小鼠血小板表面的糖蛋白表达。

1.5 粘附分析

首先，盖玻片放入100 μg/mL纤维蛋白原溶液中在室温下过夜，然后用1% 胎牛血清室温下封闭2 h。0.5 mL血小板(4 × 107/mL)放到覆盖纤维蛋白原盖玻片上反应1 h，且含有1 mmol/L CaCl2，非贴壁血小板移去，贴壁血小板被固定， Triton X-100通透，经TRITC标记的鬼笔环肽与血小板肌动蛋白结合，在荧光显微镜下观察盖玻片上的血小板。

1.6 Western blotting

收集与纤维蛋白原粘附功能增强的3xTg-AD小鼠血小板，进行全细胞裂解。BCA法蛋白定量，制备成电泳样品。组取15 μg样品，进行凝胶电泳。电泳结束后将目的蛋白转移到PVDF膜上。然后分别加入P-Akt、P-p38和β-actin抗体(1:1000)中，室温下孵育3 h。然后将膜放入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG中，孵育1 h。根据ECL试剂盒显示特异蛋白条带X光片。所得X-光胶片用Gel Doc凝胶成像分析系统分析。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 3xTg-AD小鼠血小板计算及糖蛋白表达

流式细胞分析表明，与对照WT组小鼠比较，3xTg-AD组小鼠血小板和白细胞计数差异无统计学意义(P>0.05)(图1A、B)。下一步观察两组小鼠血小板糖蛋白的表达，包括糖蛋白Ibα(CD42b)、糖蛋白α2 (CD49b)、糖蛋白αII b(CD41)和糖蛋白VI(GPVI)。流式细胞分析结果显示，两组小鼠血小板表面糖蛋白的表达差异也无统计学意义 (P>0.05)(图1C)。

2.2 3xTg-AD小鼠血小板活化状态

通过检测与整合素结合的纤维蛋白原，比较不同激活剂对两组小鼠血小板活化的影响。流式细胞结果显示，两组小鼠血小板纤维蛋白原表达相似，差异无统计学意义 (P>0.05)(图2A)。同时，研究也观察了两组小鼠血小板P-选择素的表达，不同激活剂刺激后，差异也无统计学意义 (P>0.05)(图2B)。

2.3 3xTg-AD小鼠血小板粘附功能增加

下面比较两组小鼠血小板与纤维蛋白原结合的能力，粘附分析结果表明，与对照WT组小鼠比较，3xTg-AD组小鼠与纤维蛋白原结合的血小板显著增加(P<0.01) (图3)。

图1 3xTg-AD小鼠血小板计算及糖蛋白表达Fig.1 Characterization of platelets from the 3xTg-AD mice. A,B: Platelets and white blood cells count in whole blood from WT and 3xTg-AD mice. (C) Surface expression of different glycoproteins on the platelets of WT and 3xTg-AD mice.

图2 3xTg-AD小鼠血小板活化状态Fig.2 Integrin αIIβb3 inside-out activation and P-selectin expression of the 3xTg-AD platelets. (A) Flow cytometric analysis of FITC-labeled fibrinogen binding to WT and 3xTg-AD platelets stimulated with agonist. (B) P-selectin (CD62P) expression on the platelet surface is analyzed in flow cytometry under esting and stimulated conditions.

注：WT组与3xTg-AD组相比较，***P<0.005图3 3xTg-AD小鼠血小板粘附功能(标尺=250 μm)Note. Wild type compared with the transgenic,***P<0.005Fig.3 Adhesion function of the 3xTg-AD platelets. Representative images of adherent platelets to the indicated substrates are reported (Bar=250 μm). Quantification of platelets adhesion, evaluated as number of adherent platelets/mm2.

2.4 Western blotting分析

Western blotting结果显示，与对照WT组小鼠比较，3xTg-AD组小鼠血小板P-Akt 和 P-p38表达显著的增加(P<0.05) (图4)。

注：WT组与3xTg-AD组相比较，***P<0.005图4 3xTg-AD小鼠血小板P-Akt和P-p38表达Note. Wild type compared with the transgenic mice,***P<0.005Fig.4 Expression of P-Akt and P-p38 in the 3xTg-AD platelets

3 讨论

本研究表明，与年龄相匹配的WT小鼠血小板比较，老年3xTg-AD小鼠循环血液中血小板显示出与内皮下基质(纤维蛋白原)的粘附能力增强。3xTg-AD小鼠血小板粘附能力增强或许可以解释AD患者血栓形成的风险增加[10]。使用AD小鼠模型而不是AD患者去探讨血液中血小板功能的改变具有一定的优势，并可克服内在的局限性。比如，AD小鼠通常携带特定的突变基因，其与AD的发生相关，因此，这种方法可将特定的突变基因与血小板功能改变的机制联系起来。

这些AD模型到目前为止已经用于AD的病理学多方面的研究，但是血小板功能的变化尚不明确。因此，本研究证实广泛使用的AD模型，3xTg-AD小鼠血小板粘附功能(血栓形成的初始关键步骤) 发生改变。以往在相关的AD小鼠模型，APP23小鼠中发现了血小板过度活化[11]。相对于以往的研究，本研究不仅将血小板功能分析扩展，而且采用目前广泛使用的3xTg-AD小鼠模型。事实上， 3xTg-AD小鼠与APP23小鼠一样，携带APP23突变，同时也携带早老素和tau蛋白突变。这些AD小鼠的表型和生化特征与AD患者有许多相似之处，包括过度磷酸化tau蛋白的积累[12]。

值得注意的是，我们的研究结果与已往在APP23小鼠中报道是不一致的[11]。相对于APP23小鼠，3xTg-AD小鼠与对照WT小鼠的血小板，在可溶性激动剂诱导下血小板的活化状态无显著差异。这种差异提示，不同的突变诱导的AD可能对血小板功能有影响。然而，也不能排除我们的研究结果与Jarre等人报道的差异，可能是由于血小板制备过程中存在差异[11]。然而， 3xTg-AD小鼠和APP23小鼠研究均表明AD的发病血小板功能改变有关。在3xTg-AD小鼠主要与血小板粘附功能改变；在APP23小鼠主要与激动剂诱导的血小板活化有关。在血栓形成的过程中，粘附能力改变可激活血小板，是血栓形成的关键步骤[13,14]。在本研究，我们已经证明，3xTg-AD小鼠血小板与细胞外基质粘附增加，导致血小板活化的信号通路激活，包括P-Akt 和 P-p38表达显著增加。粘附血小板的激活是后续血栓形成必不可少的步骤。

总之，本研究证实了广泛使用的AD模型，3xTg-AD小鼠血小板粘附功能发生变化，提示血小板粘附功能改变可能有助于AD相关的血管并发症。

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Changes of platelet function in Alzheimer-like triple transgenic mice and its mechanism

LIU Yuan-xin, LIU Tao

Department of Health Science, Xi’an Physical Education University, Xi’an 710068, China

Objective To investigate the changes of the platelet function in APP/PS-1/tau(3xTg) mice, a murine model for Alzheimer’s disease，and explore its mechanisms. Methods We assessed the change of function of platelet in 3xTg-AD mice by flow cytometry. Adhesion assay and Western blotting were used to compare with the data of wild type mice. Results Platelets from aged 3xTg-AD mice were normal in number and glycoprotein expression (P>0.05), but adhere more avidly on matrices such as fibrinogen, compared with the platelets from age-matching wild type mice (P<0.05). The washed platelets of 3xTg-AD mice were adherent to fibrinogen, and also showed increased phosphorylation of selected signaling proteins, including PI3 kinase effector Akt and p38MAP kinase (P<0.05). In contrast, activation induced by several agonists in 3xTg-AD mice was similar to that of wild type platelets (P>0.05). Conclusions These results demonstrate that Alzheimer’s mutations result in a significant hyper-activated adhesion state of circulating platelets, evident with the progression of the disease.

3xTg mice; Alzheimer’s disease; Platelet function

陕西省科学技术研究发展计划项目(编号：2014JM2-3027)。

刘远新(1976-)，女，研究方向：运动康复及健康促进。E-mail: liuyuanxin505@126.com。

研究报告

R-33

A

1671-7856(2017) 06-0017-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.06.004

2016-11-26