六种固定液对小鼠角膜固定效果的比较

高洪彬，林 英，宋向荣，蔡婷峰，陆丰荣，刘秋英

(1. 广东省职业病防治院，广东省职业病防治重点实验室，广州，广东 510300；2. 南方医科大学公共卫生与热带医学学院毒理学系，广州，广东 510515；3. 中山大学中山眼科中心，眼科学国家重点实验室，广州，广东 510060)

六种固定液对小鼠角膜固定效果的比较

高洪彬1,2，林 英3，宋向荣1，蔡婷峰1，陆丰荣1，刘秋英1

(1. 广东省职业病防治院，广东省职业病防治重点实验室，广州，广东 510300；2. 南方医科大学公共卫生与热带医学学院毒理学系，广州，广东 510515；3. 中山大学中山眼科中心，眼科学国家重点实验室，广州，广东 510060)

目的 观察6种不同固定液固定下，小鼠角膜的组织形态学特征并筛选出适合角膜固定的固定液。 方法 取60只NIH小鼠眼球，随机分为6组，每组10只，分别固定于6种固定液中，即95%乙醇、10%中性甲醛、Bouin’s液、甲醛-乙酸固定液和Davidson’s液。固定完成后，标本经80%、95%、100%梯度酒精脱水，TO型生物制片透明剂透明，石蜡浸泡，最后石蜡包埋。石蜡切片厚度均为4 μm，分别做HE染色，显微镜下观察形态学特征并对角膜各区域厚度进行测量分析。 结果 不同固定液固定的小鼠角膜组织形态及厚度各具特征，而甲醛-乙酸液固定后的角膜组织细胞形态改变小。 结论 甲醛-乙酸液固定后组织细胞形态改变小，是比较合适的小鼠角膜固定液。

小鼠；角膜；固定液；

角膜为眼球重要的组织结构，为多种实验模型的研究对象[1-3]。在病理制片过程中，由于标本需要经过一系列的化学试剂处理，角膜的组织形态学结构将不可避免的产生一些变化[4-6]。从而造成人工假象，并对病理学诊断造成困扰。固定液是影响病理制片质量的重要因素，为了优化角膜组织病理学观察的条件，需要相对简便、实用和可靠的固定液。本实验通过采用几种不同固定液固定下的小鼠眼球角膜，观察比较相同制片条件下不同固定液固定的小鼠角膜组织形态学特征，筛选出适合小鼠眼球固定的固定液。

1 材料和方法

1.1 实验动物及实验环境

3月龄SPF级雄性NIH小鼠30只(60眼)购自广东省医学实验动物中心，实验动物生产许可证: 【SCXK(粤)2013—0002】，实验动物使用许可证: 【SYXK(粤)2014—0048】。饲养环境条件满足国家标准 GB14925—2010《实验动物环境及设施》的要求，给予全价营养动物饲料，伽玛射线辐照灭菌，饮水为定期检测盐酸化纯净无菌水，用饮水瓶供水。

1.2 仪器与试剂

采用的仪器包括Thermo Excelsior ES脱水机、Thermo Histo Star包埋机、Thermo FN2265M0908切片机、Leica HI1220烘片机和Sanyo OMT Oven MKII型恒温烘箱、 Zeiss-Scope A1显微镜以及Leica Application Suite图像处理软件。甲醛溶液(37%～40%)、无水乙醇、二甲苯、苦味酸、乙酸，从广州化学试剂厂购得；TO型生物制片透明剂购置于中南化学试剂公司；PBS缓冲液购买于武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 取材： 30只NIH小鼠颈椎脱臼处死，取双侧眼球，共60只眼球。随机分为5组，每组10只，不切开眼球，分别固定于6种固定液中，即95%乙醇(A组)、10%中性甲醛(B组)、10%甲醛(C组)、Bouin’s液(D组)、甲醛-乙酸液(E组)和Davidson’s液(F组)。

1.3.2 固定方法：采用下述固定液浸泡固定24 h：A组固定液由100%乙醇95 mL和蒸馏水5 mL配制；B组由甲醛原液(37%～40%)10 mL和PBS缓冲液90 mL配制；C组由甲醛原液(37%～40%) 10 mL和蒸馏水90 mL配制；D组由饱和苦味酸水溶液75 mL、甲醛原液25 mL和冰醋酸5 mL配制；E组由10%中性甲醛80 mL，乙酸20 mL混合而成。F组固定液由95%乙醇30 mL、甲醛原液(37%～40%)20 mL、乙酸10 mL和蒸馏水20 mL混合而成，浸泡固定6 h后移至10%中性甲醛溶液固定液溶液中，然后继续固定24 h。

1.3.3 病理制片:固定标本经80%、95%、100%梯度酒精脱水后，TO型生物制片透明剂透明，石蜡浸泡，最后石蜡包埋。石蜡切片厚度均为4 μm，采用HE染色。各组标本同批次在相同制片条件下处理。

1.3.4 病理组织学观察: 使用显微镜进行不同固定液作用下的角膜的病理组织学观察，并对角膜中央区、旁中央区、周边区及角膜缘区使用Leica Application Suite图像处理软件进行厚度的测量。

2 结果

2.1 6种不同固定液固定的小鼠眼球角膜组织形态及厚度比较

2.1.1 各组角膜厚度：不同组别固定的角膜厚度不一。E组最厚且与小鼠角膜直接测量的结果较一致[6]，其它组别均发生了不同程度的收缩、变薄。同组别小鼠角膜从中央到周边，呈逐渐变薄趋势。

2.1.2 上皮细胞层：不同组别上皮细胞层厚度不一致。E组最厚，F组次之，A组最薄。E组镜下可见角膜上皮各层结构较整齐、层次较分明，角膜上皮表面的扁平细胞，中间层的翼状细胞及基底层的基底细胞，组织形态正常。其它组别均发生了不同程度的收缩、变薄，细胞形状也出现不同程度的压缩、变平。C、D、F组，角膜上皮各层结构较整齐、层次较分明，角膜中间层的翼状细胞胞及基底层的基底细胞轻度收缩；A、B组各角膜上皮细胞重度收缩，层次不清。

2.1.3 前界层: 各组角膜前界层在光镜下均难于观测。

2.1.4 基质层：不同组别基质层厚度不一致。E组最厚，D组次之，A组最薄。E组厚度与小鼠角膜直接测量的结果较一致[6]，镜下角膜基质平整，胶原纤维均质粉红染，纤维组织间的裂隙少见；基质中见梭形的角膜细胞散在分布，细胞形态未见明显改变。除E组之外的其它各组，基质层不同程度收缩、变薄。C组角膜基质裂隙少见，A、B组，裂隙较少，角膜细胞可见压缩变形；D、F组角膜基质松散、裂隙明显，角膜细胞形态较正常。

2.1.5 后界层： 各组角膜后界层在HE染色下均难于观测。

2.1.6 内皮细胞层： 各组均能观测到内皮细胞层，为单层扁平细胞。各组间形态学差别不大。各组角膜厚度见表1～2，各组角膜HE染色照片见图1。

表1 各组别角膜各层厚度(μm)

表2 各组别各区角膜厚度(μm)

图1 各组小鼠角膜HE染色照片(标尺=50 μm)Fig.1 Histology images of the cornea fixed in different fixative solutions. HE staining. Bar=50 μm.

3 讨论

体积分数10%中性甲醛及10%甲醛为实验室常用固定液[7,8]。由于甲醛对组织的收缩作用，因而10%甲醛溶液可引起角膜组织一定程度的收缩、变形。而体积分数10%中性甲醛溶液，由于渗透压相对10%甲醛溶液更高，在固定过程中容易使角膜水份析出，因而角膜组织收缩更明显。95%乙醇具有很强的组织收缩作用[9]，在本实验的六种固定液中，组织细胞收缩、变形的程度最严重。

Davidson‘s液及Bouin’s液对小鼠视网膜的固定效果较好[10，11]，然而在角膜的固定中，效果不理想，主要表现在角膜基质疏松、裂隙明显。这说明小鼠眼球的不同部位对固定液的收缩率不同，角膜特别是基质层组织不适合使用Davidson‘s液及Bouin’s液固定。

甲醛-乙酸液由10%中性甲醛固定液及乙酸混合而成，乙酸对组织及细胞核的膨胀作用明显[12，13]，因此二者合用可抵消10%中性甲醛固定液的收缩以及冰醋酸固定液所引起的组织膨胀和细胞核的肿胀。组织学观察，组织细胞形态与Hongmin Zhang等[14]对小鼠角膜组织未经固定直接观察的结果比较，组织细胞未见明显收缩，基质层未见明显裂隙，固定后组织细胞形态改变小。

由此可见，不同固定液固定的小鼠角膜，具有不同的形态学特征，这是进行病理组织学检查需要考虑到的问题，以免因为人工假象而造成误诊。由于甲醛-乙酸固定液固定后组织细胞形态改变小，因而是比较理想的小鼠角膜固定液。

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Comparison of the fixation effect of six types of fixatives on histology of mouse cornea

GAO Hong-bin1，2, LIN Ying3, SONG Xiang-rong1, CAI Ting-feng1, LU Feng-rong1, LIU Qiu-ying1

(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Occupational Disease Prevention and Treatment, Guangdong Province Hospital for Occupational Disease Prevention and Treatment, Guangzhou 510300, China; 2. Department of Toxicology, School of Public Health and Tropical Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515; 3. State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510060)

Objective To observe the morphological features of mouse cornea after fixation with 6 different types of fixatives, and choose an optimal fixative suitable for fixation of mouse cornea. Methods 60 eyes of NIH mice were randomly divided into 6 groups, 10 eyes in each group. The eyes were respectively fixed in the 6 types of fixatives, namely, 95% ethanol, 10% neutral buffered formalin, 10% formalin, Bouin’s solution, Formaldehyde-acetic acid fixative solution, and Davidson’s solution. After fixation, the specimens were dehydrated with 80%, 95%, 100% gradient alcohol, and clearing was performed using TO-type histological clearing agent, then soaked in melted wax, and finally embedded in paraffin. The paraffin sections were 4 μm thick, and stained with hematoxyline and eosin. The histological features of the cornea were observed and various regions of the cornea were measured. Results Different fixatives showed different histological characteristics and thickness of the mouse cornea differently. The acetic acid-formaldehyde fixative caused least changes of the morphology and thickness of the mouse cornea.Conclusions It is important to consider the impact of different fixatives on the corneal tissue morphology. In order to avoid histological artifacts, formaldehyde-acetic acid fixative among the 6 examined fixatives is the most suitable for histological examination of mouse cornea.

Mouse; Cornea; Fixative; Histology

广东省医学科学技术研究基金(编号：A2016122);广东省职业病防治重点实验室(2012A061400007)。

高洪彬(1980-)，男，研究方向：毒性病理学，E-mail: 869903043@QQ.com；林英(1980-)，女，研究方向：眼科学，E-mail: lylytulip@126.com；二者为并列第一作者。

高洪彬(1980-)，男，研究方向：毒性病理学。E-mail: 869903043@QQ.com。

研究报告

R-33

A

1671-7856(2017) 06-0049-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.06.010

2016-12-07