哺乳动物细胞培养过程控制对糖蛋白药物糖基化影响的研究进展

李潜 张彩乔 侯丽媛 张卫婷

·综述·

哺乳动物细胞培养过程控制对糖蛋白药物糖基化影响的研究进展

李潜 张彩乔 侯丽媛 张卫婷

在生物制药行业, 哺乳动物细胞培养系统, 尤其是主要是用于生产糖蛋白药物的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞应用最为广泛。蛋白质糖基化可以影响工业化糖蛋白药物的活性, 因此糖基化是重组糖蛋白药物的重要质量属性。糖蛋白药物糖基化水平的稳定性尤其需要关注, 碳水化合物结构将会决定的分子类型。最佳的糖蛋白药物就是拥有治疗效果或者筛选出同类的糖蛋白。通过调节哺乳动物细胞培养条件, 如改变细胞株, 培养基成分和过程控制等影响因素。生产融合蛋白或者单克隆抗体的生物过程变量和糖蛋白药物质量有着错综复杂的联系, 糖基化程度的优化将会提高产品功效。本文重点讨论在工业化生产中通过过程控制提升糖基化水平, 并依此了解如何控制糖蛋白药物糖基化水平。

生物工艺；哺乳动物细胞培养；蛋白糖基化；糖蛋白药物；蛋白质量

蛋白糖基化对于蛋白疗效及糖蛋白的生产至关重要。商业化生产糖蛋白药物首选哺乳动物表达系统, 因其具有天然蛋白加工机制, 包括蛋白糖基化, 这样就与天然的蛋白十分接近, 并保证治疗效果。蛋白质糖基化的形成主要是由寡糖连接到天冬酰胺的侧链(N-连接)或者连接到丝氨酸/苏氨酸(O-连接)。多糖会影响糖蛋白药物活性, 同时也会并决定该糖蛋白药物在体内的半衰期［1］。正是因为其特点, 糖蛋白药物糖型需要满足药品监管部门的要求规范, 以确保其有效性和安全性。

1 蛋白糖基化控制

在细胞培养过程控制中会影响蛋白糖基化的变量汇总。见表1。本文重点对细胞系、培养模式、生产工艺、细胞培养基这几方面对糖基化蛋白药物的糖基化影响研究进行总结。

表1 细胞培养过程控制中会影响蛋白糖基化的变量汇总

1.1 细胞系 在设计新的蛋白质疗法中, 了解一个细胞系可以影响糖基化水平十分关键。主要用于商业化生产糖基化治疗蛋白的细胞系是CHO细胞, 还有少部分使用SP2/0, 人纤维肉瘤中国仓鼠卵巢细胞(亚系克隆)(HT-1080), 人类淋巴母细胞, 小鼠骨髓瘤(NS0)细胞。有报道表明CHO悬浮细胞表达人β-干扰素与微载体贴壁CHO细胞表达的干扰素具有相同的糖型［2］。在同样组织分离的细胞的表达功能性酶种类也是多样化的, 从而表达糖基化蛋白的能力也不同。CHO细胞中CHO-K1和DUKX-B11都含有未激活的α(1, 3) GalT基因同样都有低水平的NGNA。CHO细胞生产糖蛋白药物是最普遍, 其他细胞系, 如人类胚胎肾细胞(HEK), 小仓鼠肾细胞(BHK), NS0和人类视网膜衍生细胞(PERC 6)都是正在开发生产细胞株［3,4］。

1.2 培养模式 常见的三种细胞培养方式是批式, 分批补料培养, 灌流培养。据报道不同的培养方式会明显的影响糖基化类型。CHO DG44细胞系产生的受体蛋白分泌碱性磷酸酶的糖基化蛋白特性与未扩增的细胞系在不同的培养模式下进行比较, 比较的培养模式包括批式培养, 分批补料培养,半连续灌流培养。在扩大化生产的细胞系表达的糖基化蛋白糖型中甘露聚糖较少, 同时整体的唾液酸化也较少, 但两者的差异≤10%。在灌流培养模式下糖基化总体水平较分批补料培养模式下培养的唾液酸化有所增加。总体来说, 连续灌流培养模式糖基化程度较批式培养模式有所提高, 在与批式培养模式下细胞增长速度快条件, 灌流培养模式下细胞生长速度越慢糖基化程度越高。对于采用灌流培养或者批式培养,哪种更经济还需要由糖基化蛋白自身的情况决定。

1.3 生产工艺 细胞生物反应器培养过程参数对CHO细胞表达的EPO-Fc糖基化蛋白的生物反应器培养过程的影响显著［5］。在pH为7.0时, 唾液酸比例最大可到13, 若pH升高或降低其比例会减小。同样, 培养温度从37℃降至30℃, 唾液酸比例也会由14%降至8%。生物反应器培养pH对糖基化蛋白的影响已经进行了研究。杂交细胞培养表达单克隆抗体培养基的pH对半乳糖苷化和唾液酸化作用有影响。在表达EPO时最优的pH范围为6.8～7.2时, 降低培养基pH, EPO的酸性带会增加［6］。

溶氧水平认为是在哺乳细胞培养工艺中持续监测的指标, 其会影响蛋白糖基化。在反应器中氧不足会产生对蛋白糖基化产生复杂的影响。例如, 溶氧的变化对于在CHO细胞表达tPA糖基化蛋白影响较小, 但是溶氧很小的改变会对CHO产生促卵泡激素(FSH)糖基化作用产生明显影响。

铵离子是细胞代谢废物, 主要是因为谷氨酰胺和天冬酰胺代谢产生的铵离子, 其在培养基中积累一般会对细胞有毒性。氯化铵会导致胞内pH降低, 导致最终糖基化发生在高尔基复合体的酸性区域, 增加细胞内pH可能与最终唾液酸化作用的减少有关系。

降低温度可以延长细胞活力, 从而提高所有蛋白表达,原则上也可以增加糖基化。细胞活力是十分重要的因素, 因为胞外糖基化酶可以在培养基中积累逐步将单糖从聚糖上移除。在生物反应器中温度的改变可以提高单位体积表达蛋白的活性, 同时可维持糖型质量［7］。相比之下, 当温度降低到33℃和30℃, EPO-Fc唾液酸化作用分别减少20%和40%［8］。降低温度到30℃, 显示了提高产量和降低唾液酸化作用的相关性。目前仍然无法解释对高生产能力和高表达量是否正相关。高细胞活力(低唾液酸酶活性)与高细胞产量相关(更短的滞留时间)可能会降低整体唾液酸化作用影响。

生物反应器剪切力是一个非常重要的工程学变量, 可影响糖型特征。通过改变搅拌速度和剪切力, 发现最大的破坏性剪切力水平必须要达到tPA 天冬酰胺184位点最小程度的占用, 原因是剪切力减少了tPA在内质网中的停留时间。在工艺放大或者现有工艺转移过程中剪切力是需要重点考虑的, 监测剪切力对蛋白糖基化不同表型的影响(例如从灌流培养到批式培养), 同样是产品一致性非常重要的保证。

1.4细胞培养基 哺乳动物细胞培养基基本上由50～100种化学限定性的物质组成, 同时还有少数不确定物质这些物质有时作为补料。这些不确定的物质包括蛋白胨、酵母抽提物、植物水解物和血清。已有文献报道一些不确定物质在糖基化蛋白中的影响。目前, 血清和动物来源物质因其不确定性和安全性风险, 不推荐在生物制药工业中使用。

已明确的培养基成分如葡萄糖, 谷氨酰胺, 半乳糖都在糖基化控制中起了担任了十分重要角色。葡萄糖限量的CHO细胞连续培养表达无糖基化的IFN-γ是可以的。CHO批式培养生产IFN-γ发现在低于0.1 mmol/L的谷氨酰胺和0.7 mmol/L的葡萄糖条件下, 可以降低唾液酸化作用类型和增加高甘露糖型的杂合聚糖。相比之下, 在低葡萄糖和谷氨酰胺浓度的条件下, 连续培养和非营养限制性培养模式下对比, BHK-21细胞表达人IgG-IL2融合蛋白时显示出在寡糖型的不同的。半乳糖的流加可以帮助促进形成更多半乳糖化的N-聚糖型。

通常, 培养基中小分子会引起细胞行为改变, 例如高特异性的表达。研究表明丁酸钠可以提高产量, 同时可以降低细胞生长速度通过上调细胞凋亡作用和调节唾液酸化作用［9］。丁酸钠在基因和蛋白表达水平方面的多效性影响, 在哺乳动物细胞表达中已经报道多次［10］。

氨基酸添加量对哺乳动物生长和表达目的蛋白十分重要, 但是特定的浓度会导致糖基化类型的改变。添加额外的氨基酸(半胱氨酸, 异亮氨酸, 亮氨酸, 色氨酸, 缬氨酸, 天冬酰胺, 天冬氨酸和谷氨酸)这些在早期培养过程中会耗尽,导致rhEPO中低唾液酸化部分增加。

2 讨论

哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因工程药物的生产平台, 在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起到了极为重要的作用。哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠, 提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能, 因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。

本文重点对在细胞系、生产工艺、培养模式和培养基对糖蛋白药物糖基化的影响进行讨论并总结, 目的为持续生产出稳定、一致的糖蛋白药物提供理论支持。糖基化的控制更多的是基于工艺控制和细胞生理代谢控制。通过总结过去的研究结果了解细胞代谢途径, 希望最终可以控制蛋白糖基化。未来目标是通过前期的基础研究, 将新技术、新细胞系表达蛋白的糖基化水平做到可控并获得满足要求的糖蛋白, 真正的达到质量源于设计(QbD)的要求。

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.14.112

2017-03-16］

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