唾液酸的制备和生物活性研究进展

王梦花，林小仙，琚萌萌，阴佳璐，王东亮*，王姝麒*

(1.山东大学药学院，山东 济南 250012；2.北京小仙炖生物科技有限公司,北京 100020;3.河北省燕窝鲜炖技术创新中心,河北 廊坊 065700)

唾液酸是含9个碳的α-酮酸，因其存在的位置和形式不同，唾液酸具有多种活性。位于大脑中的唾液酸，对大脑的发育中起着重要的作用，能够提高记忆力和促进脑部发育，唾液酸在细胞保护、免疫、抗病毒和抗肿瘤等过程中也发挥着重要作用。唾液酸的主要来源有母乳、乳制品和燕窝，其中燕窝的营养价值巨大，是食物中唾液酸的主要来源。近5年来对燕窝的研究大多与唾液酸有关，燕窝中的唾液酸主要以结合态存在，游离态仅占2%左右[1]，结合态的唾液酸即唾液酸与细胞表面复杂的多糖结合进而发挥作用。唾液酸的制备方法很多，其中微生物发酵和全细胞合成制备唾液酸用到的原料便宜、能源消耗低且对环境影响小。本文研究并总结了唾液酸的来源、制备方法、检测方法以及其生物活性，对进一步的针对唾液酸的开发利用提供了理论基础和参考。

1 唾液酸的来源

唾液酸，又称为神经氨酸，通常由不同的糖苷键(α-2,3-、α-2,6-、α-2,8-或α-2,9-)[2]连接在糖蛋白和糖脂的非还原端。唾液酸家族现已超50种以上化合物，其中N-乙酰基神经氨酸(Neu5Ac)、N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)这两种最为丰富和重要(结构图见图1)。N-乙酰基神经氨酸(Neu5Ac)不仅是人体中的内源性唾液酸，还是神经系统不可或缺的结构和功能成分[3]。唾液酸最早由Blix等[4]采用弱酸水解的方法从牛的唾液腺粘蛋白中提取分离得到。研究发现，在动物、植物、真菌、细菌中都可以发现唾液酸的存在，随着生物进化程度的增加，唾液酸的种类和含量也在增加，如人类及其他哺乳动物等高等动物体内的唾液酸含量要高于低等动物[5]。唾液酸的食物来源主要是燕窝、母乳、乳制品和鸡蛋。研究表明，唾液酸在鸡蛋和牛奶中的含量分别为0.07%和0.01%[6]。母乳和燕窝中的唾液酸含量很高，Wang等[7]测得母乳初乳中的唾液酸含量可高达2 201.4 mg·L-1，Huang等[8]用高效液相色谱法测定了马来西亚和印度尼西亚所产燕窝中的唾液酸的含量，含量均在10%左右。

图1 唾液酸的结构

2 唾液酸的制备

唾液酸的制备方法主要包括天然产物提取、化学法与酶法合成、微生物发酵法、全细胞合成。天然产物中唾液酸的含量较低，不易进行大规模工业化生产。化学法与酶法合成结合使用要求酶是纯化的，制备过程较烦琐。微生物发酵和全细胞合成与其他方法相比具有环境友好性、操作简单、成本低等优点，相比微生物发酵法，全细胞合成缩短了生产周期，提高了底物转化率，降低了能耗。

2.1 天然产物提取 天然产物提取是从含有唾液酸的天然资源中提取唾液酸，如燕窝、禽蛋、鸡蛋、茄子、牛奶，常用的提取方法有水提法、酸提法和酶提法。20世纪70年代Martin等[9]用热水在燕窝中提取到了唾液酸，Wong等[10]使用盐酸模拟胃液将燕窝中的糖蛋白水解成较小的肽，N-乙酰神经氨酸从其结合形式中释放出来。酸法提取的过程中产物容易发生降解，酶法提取相对温和，产物比较稳定，因此研究者尝试用唾液酸酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶对唾液酸进行提取。陈昕露[11]用木瓜蛋白酶提取燕窝中的唾液酸，并对其加工条件进行了优化，产物提取率较传统水提法提高了38.58%。李敬等[12]采用超声辅助酶法提取燕窝中的唾液酸，用响应面法优化燕窝唾液酸的提取工艺，在最佳优化工艺参数下，测得燕窝唾液酸的提取率为84.76%。由于天然产物中唾液酸的含量较低，分离纯化的过程比较复杂，回收率低，因此不易进行大规模工业化生产。

2.2 化学法与酶法合成 唾液酸的化学合成法第一步N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)与二叔丁基氧代丁二酸的钾盐进行缩合，第二步碱的催化下脱羧，生成N-乙酰神经氨酸。此方法不仅需要高温、高压这些苛刻的条件，且催化剂铟有毒，产物后处理也非常的复杂且收益较低，因此不能满足大规模的工业化生产。酶法合成通常用N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NanA)催化N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)生产唾液酸，其缺点就是底物价格较贵。在实际应用中化学合成与酶合成法一般结合使用[13]。Hu等[14]使用亲和色谱法纯化了大肠杆菌中的N-乙酰差向异构酶(AGE)和NanA，将这两种酶固定化在树脂上，在反应器中将N-乙酰葡萄糖胺生产为唾液酸，转化率达到了73%。

2.3 微生物发酵法 与化学法以及酶法合成相比，微生物发酵法生产唾液酸具有环境友好性，能源消耗低，不需要添加酶，工艺操作简单，原料易得等优点。但是微生物发酵法具有产物浓度低，且常伴有副产物的缺点，可以通过减少分解代谢、改变合成途径和平衡前体物的供应来提高其产率[15]。由于合成唾液酸的细菌大多是致病菌，因为大肠杆菌是生物安全的，且其代谢工程遗传工具系统功能强大，且发酵工艺成本低[16]，所以常被作为合适的细菌合成唾液酸。过去主要在发酵罐中生产唾液酸，de Vries等[17]用大肠杆菌在一次性袋式反应器中生产聚唾液酸，改善了发酵工艺，其浓度达到了245 mg·L-1。随着对发酵机制和代谢工程深入研究，研究人员通过调节唾液酸的生物合成途径来提高产率，如Chen等[18]通过敲除编码NanA的基因，过量表达唾液酸胞苷单磷酸酯合成酶(NeuA)、N-乙酰神经氨酸7-O-乙酰基转移酶(NeuD)和聚唾液酸转移酶(NeuS)，构建了高效的重组大肠杆菌菌株，减少了唾液酸的分解代谢，聚唾液酸的产量提高了85%。枯草芽孢杆菌也可发酵生产聚唾液酸，李思杰等[19]优化了Pholin启动子，构建质粒具有能够编码N-乙酰神经氨酸合成酶(NeuB)和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶(NeuC)的基因，在枯草芽孢杆菌中生产唾液酸，其产量达到了0.226 g·L-1。Zhang等[20]对枯草芽孢杆菌中合成唾液酸的3条途径的关键酶的来源进行了比较和优化，并对这些途径进行了组合和优化，分批补料进行发酵，唾液酸的产量达到了30.10 g·L-1，且这一方法不需要构建质粒。Zhang等[21]用模块化路径工程对N-乙酰葡萄糖胺和磷酸烯醇式丙酮酸的供应进行了平衡，唾液酸在枯草芽孢杆菌中的产率提高了5倍。

2.4 全细胞合成 全细胞合成是介于酶法合成和微生物发酵中间的一种合成方法，与酶法合成相比，全细胞合成过程相对简单，不需要纯化的酶，降低了成本。以往通常用两种不同的宿主偶联生产唾液酸。Tao等[22]构建了大肠杆菌的突变体，将AGE和NanA催化的两个反应包装在突变体的单细胞中，安全的温度诱导载体降低了副反应和传质阻力，生物转化效率比偶联细胞生产高10倍。Gao等[23]从人肠道中的多形拟杆菌属中鉴定了一个编码AGE的基因BT0453，构建了能表达AGE和NanA的大肠杆菌生产唾液酸，产率可高达53.6%。丙酮酸在相关酶的催化下能生成副产物乙偶姻，Zhao等[24]优化了控制AGE和NanA的启动子，敲除编码乙酰乳酸合成酶的基因alsS和编码乙酰乳酸脱羧酶的基因alsD，丙酮酸的副产物减少，原料增加，相应的GlcNAc的摩尔转化率达到了55.57%，这同时也证明了枯草芽孢杆菌和大肠杆菌一样是可以生产唾液酸的全细胞催化剂。

3 唾液酸的检测方法

高效液相色谱法是检测唾液酸最常用的方法，常与不同的检测技术结合来检测衍生化的唾液酸，其灵敏度和准确性较高。相比高效液相色谱法，传感器检测法一般不需要对样品进行预处理，具有选择性强和检测快速的优点。

3.1 高效液相色谱法 高效液相色谱一般与不同的检测技术结合来检测唾液酸，HPLC-MS具有高灵敏度和高准确性的优势，但由于昂贵的试剂和难以获得稳定的衍生分子，阻碍了该方法应用。王天娇等[25]应用高效液相色谱-二极管阵列检测器法来检测人血清中的唾液酸，并测得回收率为87.9%～100.4%，相对标准偏差分别为1.2%～3.0%，此方法的回收率、重现性、灵敏度均很好，对于定性或定量检测血清中唾液酸的含量非常有效。徐柳柳等[26]用4,5-亚甲二氧基-1,2邻苯二胺盐(DMB)试剂衍生化唾液酸，利用液相-荧光检测器检测酸奶中的唾液酸含量，克服了杂质干扰，灵敏度也较高。Li等[27]通过使用吉拉德试剂P对唾液酸进行衍生化，在电喷雾正离子模式下的选择性离子检测对唾液酸进行定量分析，此方法灵敏高、稳定且通用，满足了游离唾液酸(FSA)和总唾液酸(TSA)检测的临床需要。

3.2 传感器检测法 传感器检测法之前研究的传感器大多数是酶生物传感器，由于酶的活性具有易发生变化、不稳定、成本比较高等缺点，研究者开始致力于寻找更加稳定、简单、灵敏的传感器，目前比色传感器、分子印迹传感器、荧光传感器、电化学传感器都广泛用于唾液酸的检测。

电化学发光生物传感器的灵敏很高，但易受环境、仪器波动的干扰，为了解决这一问题，有研究者提出了电化学发光比率传感器的策略，Cao等[28]首次提出以Ru(bpy)32+掺杂二氧化钛纳米粒子[TiO2-Ru(bpy)32+NPs]和聚乙烯亚胺(PEI)修饰的硫化镉(CdS)量子点(PEI-CdS QDS)作为电化学发光单元，分子印迹聚合物(MIP)作为识别元件，得到了一种高性能的抗干扰的电化学发光比率传感器。唾液酸中含有一个甘油侧链，硼酸可以与甘油侧链中的二醇结构发生反应。Chen等[29]用有机电化学晶体管作为传感平台，该晶体管有漏极、源极、栅极三个电极，栅电极用羧基化的多壁碳纳米管修饰，共价结合3-氨基苯硼酸，3-氨基苯硼酸特异性识别唾液酸，从而使栅电极的电压发生改变，在0.1～7 mmol·L-1范围内非常灵敏，且非常便捷，这种基于晶体管的生物传感器在唾液酸的检测中具有潜在的巨大价值。

荧光法测定唾液酸，具有操作简单、灵敏度高、选择性强等优点。Yu等[30]设计并合成了一种新的有机金属框架UiO-66-NH2@B(OH)2，UiO-66-NH2@B(OH)2中的硼酸官能团识别唾液酸，使其荧光减弱甚至淬灭，通过小鼠实验验证，此法的检出限低至0.025 mmol·L-1，线性范围为0.05～2.5 mmol·L-1，具有灵敏度高和选择性好等优点。

4 唾液酸的生物活性

唾液酸的生物活性主要与其存在的形式和位置有关。细胞表面的唾液酸具有介导免疫黏附、细胞识别和信号传导等作用，生物体内的唾液酸具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、促进脑部发育等作用。

4.1 促进脑部发育和提高记忆力 脑组织的中唾液酸含量比身体其他组织都要高，大脑组织中70%结合态唾液酸以神经节苷脂的形式存在[31]，神经节苷脂是一种酸性鞘糖脂，参与突触的形成和神经的传递，而记忆力形成结构基础是稳定的突触连接[32]，有研究证明缺乏了唾液酸的婴儿出现了严重的发育迟缓[33]，Xie等[34]发现在妊娠期或哺乳期给予母鼠燕窝(EBN)，可以改善其后代的学习和记忆功能，表明了唾液酸在神经元发育中的作用。有研究表明在哺乳期提供唾液酸和唾液酸化寡糖，可以增强大鼠的长时程增强作用(LTP)和改善大鼠的记忆力[35]。唾液酸还可以与其他药物协同使用治疗神经疾病，如成亚渝等把更昔洛韦和单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)联合起来治疗疾病，发现其能够显著减轻病毒性脑炎伴精神行为异常患儿的症状，提高患者的神经营养因子的水平，这都证实了唾液酸起着促进脑部发育和提高记忆力的作用[36]。

帕金森是一种神经退行性疾病，临床研究表明GM1可用于治疗帕金森[37]，为了探讨其治疗机制，蒋暐卿等[38]将鱼藤酮注射到小鼠中，诱导其产生帕金森，进而对GM1的治疗机制研究，最终证实GM1能保护神经元细胞，抑制神经元细胞的凋亡，减缓帕金森大鼠的行为学改变。Careena等[39]通过实验证明燕窝提取物可以对抗内毒素诱导的神经炎症，并逆转内毒素诱导的神经损害，因此燕窝可以作为预防帕金森的一种食物。

4.2 抗病毒 唾液酸不仅是细菌的受体，还是病毒的常见的受体，由此可以通过对唾液酸进行研究探寻抗病毒的新方法。病毒包膜主要由血凝素和神经氨酸酶两种物质组成，血凝素与唾液酸受体结合，病毒在靶细胞中进行增殖，通过神经氨酸酶裂解唾液酸残基，使病毒从宿主细胞中释放出去，因此可以靶向宿主唾液酸和靶向病毒与受体结合的区域来抗病毒。DAS-181通过裂解宿主细胞上的唾液酸来抑制宿主细胞和病毒的结合，Danziger-Isakov等[40]用DAS-181成功治疗了2019年冠状病毒继发性呼吸窘迫的10个月大的婴儿。有研究用一种小分子化合物CM9与血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白相互作用，改变融合蛋白(F)的构象，能够使病毒感染受阻[41]。Eveno等[42]用唾液酸的衍生物BCX-2798作为抑制剂与HN蛋白的关键成分共价结合，有效地抑制了病毒的复制。唾液酸的功能与酶的作用密切相关，乙酰化是神经氨酸最常见的修饰，Huang等[43]发现人类冠状病毒(hCoV-HKU1)的决定受体是9-O-乙酰化唾液酸，hCoV-HKU1能够编码蛋白血凝素酯酶蛋白(HE)，HE主要作为冠状病毒的受体破坏酶(RDE)促进病毒子代释放。唾液酸酶抑制剂的抗病毒作用在抗流感病毒领域得到广泛应用，因为唾液酸酶的活性是从宿主细胞上释放新形成的病毒所必需的，抑制该酶可以阻止病毒感染的传播，奥司他韦是该酶的常见抑制剂，Zhao等[44]设计了一种酰腙类神经氨酸酶抑制剂，其IC50要低于奥司他韦。

燕窝是唾液酸的主要食物来源。Guo等[45]的研究表明燕窝提取物可以抑制流感病毒的感染。Haghani等[46]研究燕窝抗流感病毒的机制，发现燕窝可促进溶酶体的降解、减少自噬小体的积累，从而有效地减少甲型流感病毒的复制，且活性与唾液酸的含量正相关。

4.3 抗炎 近年来对唾液酸的研究主要集中在抗肿瘤功能和神经发育功能，对抗炎的功能研究较少。陈斯玮等[47]的研究发现唾液酸能够提高小鼠的免疫功能，且与剂量成正相关。白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-10(IL-10)在炎症和免疫中均起主要作用，具有抗炎的特性，Payazdan等[48]通过研究发现，唾液酸可以增强IL-4和IL-10基因的表达，IL-4和IL-10增多，抗炎作用增强。刘伟等[49]通过研究也发现唾液酸能够降低白介素-6、肿瘤坏死因子等致炎因子的释放，增加前列腺素E2释放，从而发挥抗炎作用。唾液酸的浓度还可用来区分炎症的类别，Gruszewska等[50]的研究表明可以通过测定总唾液酸的浓度来区分慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎。

4.4 抗肿瘤 唾液酸在肿瘤细胞中高度表达，因此唾液酸可以作为肿瘤标志物来诊断肿瘤，有助于肿瘤的治疗。Achalli等[51]通过研究发现，与健康对照组相比，口腔癌患者的血清和唾液中的唾液酸的平均水平显著增加，因此血清和唾液中的唾液酸可作为生物标志物来诊断口腔癌。Li等[52]开发了一种新的试剂盒，可以同时检测血清中唾液酸和羟脯氨酸的浓度，结果表明，与传统的肿瘤标志物人附睾蛋白4和碳水化合物抗原125相比，唾液酸和羟脯氨酸的联合检测具有更高的诊断价值，可用于卵巢癌的诊断和动态检测。

5 总结

唾液酸的来源广泛，可通过天然产物提取、微生物发酵、全细胞合成、化学法和酶法合成制备。微生物发酵和全细胞合成具有环境友好性、操作简单和成本低等优点，一些合理的设计方法(改变合成路径，减少分解代谢、基因重组)都可以提高其产量，是两种非常具有研究前景的制备技术。检测唾液酸最常用的方法是高效液相色谱法，相比高效液相色谱法，传感器检测法一般不需对样品进行预处理，且检测快速、准确性高。唾液酸具有多种生物活性，如促进脑部发育、抗炎、抗病毒、抗肿瘤。未来的研究可能集中于探索唾液酸的新的生理功能以及其作用机制，并需要开发新的分析方法来探索其作用。随着分析方法和合成方法的不断完善、生理功能的不断发现，唾液酸在未来会更好地造福人类。