冬凌草甲素诱导胶质瘤SHG44细胞凋亡及其分子机制的研究

朱莽，龙乾发，杨彦平，樊欣鑫，谢江涛，姜海涛

（1.西安市第三医院神经外科，西安710021；2.西安市中心医院神经外科，西安710003；3.咸阳市中心医院神经外科，陕西咸阳712000；4.西安交通大学第一附属医院神经外科，西安710061）

冬凌草甲素诱导胶质瘤SHG44细胞凋亡及其分子机制的研究

朱莽1，2，龙乾发2，杨彦平2，樊欣鑫2，谢江涛3，姜海涛4

（1.西安市第三医院神经外科，西安710021；2.西安市中心医院神经外科，西安710003；3.咸阳市中心医院神经外科，陕西咸阳712000；4.西安交通大学第一附属医院神经外科，西安710061）

目的研究冬凌草甲素诱导胶质瘤SHG44细胞凋亡及其分子机制。方法采用CCK-8比色法绘制生长曲线，冬凌草甲素分别以0、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L观察对胶质瘤SHG44细胞生长活性的影响；Hoehst33258和TUNEL染色法观察细胞形态的变化，流式细胞仪检测细胞凋亡情况；通过Western blotting分析凋亡相关蛋白Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bax和Bcl-2在胶质瘤SHG44细胞中蛋白的表达情况。结果冬凌草甲素作用胶质瘤SHG44细胞24 h和48 h后，细胞的增殖受到明显抑制，且24 h和48 h细胞半抑制率（IC50）的浓度分别是7.865和4.74 μmol/L；Hoechst33258和TUNEL染色结果发现形态发生明显改变，出现了典型的细胞凋亡变化；Western blotting检测结果显示冬凌草甲素诱导后，下调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达，并激活了凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表达。结论冬凌草甲素对胶质瘤SHG44细胞具有抑制增殖及诱导凋亡的作用，同时调控凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax的表达。

冬凌草甲素；胶质瘤；SHG44细胞；细胞凋亡

脑胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤。胶质瘤的治疗当前主要以手术切除为主，但疗效差、易复发，目前临床上还未有突破性进展［1］。脑胶质瘤化疗药物辅助治疗是目前的研究热点之一［2］，该治疗方法可以提高患者生活质量，同时延长患者的生存期。近年来研究［3］发现，冬凌草甲素具有良好的抗癌活性，几乎无不良反应，但其在胶质瘤方面的研究较少。本研究以高级别人胶质母细胞瘤细胞株SHG44为研究对象，探讨冬凌草甲素对SHG44细胞增殖抑制的影响，并探索其可能的作用机制，为治疗胶质瘤提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 材料

冬凌草甲素购自Sigma公司，DMSO配制100 μmol/L，分装后-20℃储存备用。胶质瘤SHG44细胞株购自于中国科学院上海细胞库，胎牛血清、改良Eagle培养基（dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM）和胰蛋白酶均购自Gibco公司，CCK-8试剂盒购自上海鸿立生物技术有限公司、TUNEL试剂盒购自罗氏公司，Hoechst33258荧光试剂盒、青霉素和链霉素均购自Sigma公司；Caspase3、Bcl-2、Bax和Actin兔的多克隆抗体均购自美国ABcam公司。酶联检测仪和蛋白电泳设备装置均为北京天能公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，于37℃、5%CO2孵箱中常规培养胶质瘤SHG44细胞，0.25%胰蛋白酶消化、传代继续培养，取对数生长期细胞进行实验研究。

1.2.2 CCK-8观察细胞增殖：取对数生长的SHG44细胞，调整细胞密度2×104/mL，终浓度分别为0、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L的冬凌草甲素作用SHG44细胞24 h、48 h，对照组给予等量的DMSO；每个浓度设6个负孔并以空白孔调零，各组细胞培养24 h后，将培养液换成不同浓度含有冬凌草甲素的培养基，继续培养。随后每孔加入10 μL CCK-8溶液继续培养2 h。酶标分析仪检测450 nm波长的光密度值（optical density，OD）。抑制率（%）=（OD对照组-OD实验组）/OD对照组×100%。

1.2.3 凋亡细胞的Hoechst33258荧光检测：将细胞接种于24孔板，培养过夜，换成含0、5、10 μmol/L的冬凌草甲素的DMEM培养液，继续培养24 h，按照荧光染色试剂盒说明书逐步进行操作，倒置荧光显微镜下拍照。

1.2.4 TUNEL染色：取对数生长期的SHG44细胞接种于15 mm盖玻片上，分别以0、5、10 μmol/L的浓度给予冬凌草甲素处理24 h后，4%多聚甲醛固定30 min、0.15%Triton X-100破膜5～10 min，按照TUNEL试剂盒说明书具体操作步骤逐步进行，甘油封片后倒置荧光显微镜下观察凋亡细胞并拍照。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡：分别设对照组和冬凌草甲素处理组（5、10 μmol/L），收集各组细胞悬液，调整细胞密度1×106/mL，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2次。后续按照Annexin V FITC试剂盒说明书进行操作，分别加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI轻柔振荡混匀，4℃避光反应30 min，用流式细胞仪定量分析细胞凋亡水平。

1.2.6 Western blotting：将对数期细胞正常培养组设对照，然后换液加入稀释好的5、10 μmol/L冬凌草甲素药物干预设48 h，用预冷的0.01 mol/L PBS漂洗细胞，用SDS裂解液裂解细胞，冰浴超声提取蛋白，并进行蛋白定量分析。制备SDS-PAG凝胶，在电压的作用下分离蛋白，在将凝胶蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉，室温封闭1 h，分别参照抗体说明书比例，稀释一抗Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax和Actin兔抗人的多克隆抗体，4℃冰箱孵育过夜。然后加入标记山羊抗兔IgG抗体，室温孵育2 h，暗室，曝光并进行扫描图像分析仪计算蛋白条带的表达。

1.3 统计学分析

应用SPSS 12.0软件进行统计学分析，实验数据以x±s表示，组间差异采用Dunnett-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度冬凌甲草素对胶质瘤SHG44细胞的抑制作用

以0、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L浓度冬凌草甲素作用于胶质瘤SHG44细胞24、48 h后，CCK-8检测药物对SHG44细胞生长的影响，发现冬凌草甲素能显著抑制SHG44细胞增殖，有明显的时间、剂量依赖性。各浓度处理24、48 h后细胞的OD值及抑制率相比差异有统计学意义（P均＜0.05），冬凌草甲素对胶质瘤SHG44细胞半数抑制率（half maximal inhibitory concentration，IC50）分别为24 h，7.865 μmol/L和48 h，4.74 μmol/L，见图1。

2.2 细胞凋亡后Hoechst33258染色形态改变

用含有0、5、10 μmol/L冬凌草甲素的DMEM培养基培养胶质瘤SHG44 48 h后，Hoechst33258细胞染色结果显示，随着药物作用浓度的增加，细胞皱缩，细胞核碎裂，细胞凋亡明显增多，见图2。

2.3 TUNEL染色观察冬凌草甲素诱导SHG44细胞凋亡

TUNEL染色结果显示，SHG44细胞经不同浓度冬凌草甲素处理48 h产生凋亡改变，正常的SHG44细胞无荧光激活，见图3。

图1 冬凌草甲素对胶质瘤SHG44细胞的增殖抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of Oridonin on proliferation of SHG44 ce lls

2.4 AnnexinV-FITC/PI检测细胞凋亡结果

利用流式细胞仪检测对照组和5、10 μmol/L冬凌草甲素处理48 h后SHG44细胞的凋亡水平，结果显示，与对照组SHG44细胞相比，经药物处理后的SHG44细胞随药物浓度增高发生凋亡数量增多（包括凋亡早期和晚期），凋亡率增高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1，图4。

2.5 Western blotting结果

在冬凌草甲素诱导作用48 h后，SHG44细胞有凋亡发生，Western blotting结果显示，SHG44细胞中Caspase-3和Bcl-2蛋白表达随药物作用浓度增高而减弱，而cleaved Caspase-3和Bax在冬凌草甲素5 μmol/L浓度时蛋白表达增高，10 μmol/L时蛋白表达减弱。见图5。

图2 冬凌草甲素作用下胶质瘤SHG44细胞的形态变化×200Fig.2 Morphologica l changes in SHG 44 ce lls a fter Oridonin treatm ent×200

图3 冬凌草甲素对胶质瘤SHG44细胞诱导凋亡的影响×100Fig.3 Apop tosis-inducing e ffects of Oridonin in SHG44 ce lls×100

3 讨论

冬凌草甲素是唇形香茶属植物冬凌草的最主要抗肿瘤成分，是贝壳杉烯骨架的四环二菇类化合物［4］，1967年其显著抗细胞增殖活性被首次报道［5］。目前多项研究［6-7］发现，冬凌草甲素能诱导肿瘤细胞发生凋亡。YE等［8］研究发现冬凌草甲素可诱导小鼠纤维肉瘤L929细胞发生自噬，其作用机制与一氧化氮（NO）-ERK-p53正反馈环信号通路有关；WANG等［9］研究发现冬凌草甲素还可以抑制肿瘤细胞的迁移。高级别胶质瘤由于生长速度快，呈浸润性生长，手术难以完全根除，且对放、化疗均不敏感，患者生存期短、预后差。越来越多研究者在高级别胶质瘤的综合治疗方面一直在不断地探索寻找新的途径与治疗方法，提高患者的生活质量，延长患者的生存期［10］。尹波等［11］在C6大鼠脑胶质瘤裸鼠移植模型中发现冬凌草甲素对大鼠C6脑胶质瘤增殖具有抑制效果，且随着药物剂量增加，抑制率逐渐上升，具体机制不明。因此，本研究探讨冬凌草甲素对体外人脑胶质瘤SHG44细胞的作用及其机制。调抑凋亡蛋白Bcl-2的表达，活化Caspase-3，促进细胞凋亡，通过促进人胶质瘤SHG44细胞的凋亡发挥其抗肿瘤的重要作用。

图4 冬凌草甲素诱导SHG44细胞凋亡Fig.4 Results for Oridonin-induced SHG 44 ce ll apoptosis

表1 冬凌草甲素对SHG44细胞凋亡的影响（x±s）Tab.1 Results for Annexin V-FITC staining（x±s）

图5 Western blotting检测各组细胞中Caspase l-3、cleaved Caspase3、Bcl-2和Bax蛋白的表达Fig.5 Western b lotting ana lysis of Caspase-3，cleaved Caspase-3，Bcl-2，and Bax protein expression in each group of cells

冬凌草甲素对不同肿瘤细胞的抑制途径各不相同，说明冬凌草甲素可能通过多种途径作用于肿瘤细胞，发挥其抗肿瘤作用，且与某些化疗药物联合应用时能够增强化疗药物疗效［12］，但是冬凌草甲素在小鼠体内半衰期较短［13］，目前尚无其能否通过血脑屏障的报道，这些都是未来探索的方向。

综上所述，冬凌草甲素对胶质瘤SHG44细胞具有显著的抑制生长的作用，这种作用与其诱导胶质瘤SHG44细胞凋亡的效应有关，且有望成为治疗脑胶质瘤的有效新药。冬凌草甲素作用于胶质瘤细胞的机制和调控的其他途径，及能否通过血脑屏障等动物实验尚待进一步研究证实。

本研究发现，体外冬凌草甲素在不同浓度、不同时间对人胶质瘤SHG44细胞增殖均有显著抑制作用，Hoechst33258、TUNEL细胞染色和流式细胞术结果从形态和数据上均相互印证人胶质瘤SHG44细胞生长抑制与细胞凋亡有关，且抑制增殖和凋亡与冬凌草甲素呈时间和浓度依赖性。为了进一步检测冬凌草甲素促进人胶质瘤SHG44凋亡机制，通过Western blotting检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和cleaved Caspase-3蛋白的表达水平情况，发现冬凌草甲素可能通过促进Bax的表达和下

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（编辑于溪）

Mechanism of Oridonin-induced Apoptosis of Glioma SHG44 Cells

ZHU Mang1，2，LONG Qianfa2，YANG Yanping2，FAN Xinxin2，XIE Jiangtao3，JIANG Haitao4

（1.Department of Neurosurgery，The Third Hospital of Xi’an，Xi’an 710021，China；2.Department of Neurosurgery，Central Hospital of Xi’an，Xi’an 710003，China；3.Department of Neurosurgery，Central Hospital of Xian yang，Xianyang 712000，China；4.Department of Neurosurgery，The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiao Tong University，Xi’an 710061，China）

Objective To study the molecular mechanism of oridonin-induced apoptosis of glioma SHG44 cells.Methods A growth curve was plotted using CCK-8 colorimetric method with different concentrations of oridonin（0，1.25，2.5，5，10，20，and 40 μmol/L）to observe its effect on the growth of SHG44 cells.Hoechst33258 and terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling（TUNEL）staining were used to examine the changes in cell morphology and flow cytometry was used to detect cell apoptosis.Western blotting was used to analyze the expression of apoptosis-related proteins（Caspase-3，cleaved Caspase-3，Bax，and Bcl-2）in SHG44 cells.Results SHG44 cell proliferation was significantly suppressed after 24 and 48 h Oridonin treatment，with a half-maximal inhibitory concentration of 7.865 and 4.74 μmol/L，respectively. Hoechst33258 and TUNEL staining showed changes in cell morphology such as shrinkage and nucleus fragmentation and morphogenesis，which are indicative of apoptosis.Western blotting analysis showed that oridonin inhibited the expression of Bcl-2 and activated the expression of Caspase-3 and Bax.Conclusion Oridonin can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of SHG44 cells by regulating the expression of apoptosis-related proteins.

oridonin；glioma；SHG44 cells；cell apoptosis

R739.41

A

0258-4646（2017）07-0604-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.007

国家自然科学基金（31301216）

朱莽（1985-），男，主治医师，硕士.

朱莽，E-mail：mzfly@126.com

2016-10-26

网络出版时间：