远端上游元件结合蛋白1在胃癌中的表达及其对胃癌细胞增殖和侵袭能力的影响

李丹，黄宝俊，赵丹懿

（1.大连医科大学附属第二医院肿瘤科，辽宁大连116027；2.中国医科大学附属第一医院肿瘤外科，沈阳110001）

远端上游元件结合蛋白1在胃癌中的表达及其对胃癌细胞增殖和侵袭能力的影响

李丹1，黄宝俊2，赵丹懿1

（1.大连医科大学附属第二医院肿瘤科，辽宁大连116027；2.中国医科大学附属第一医院肿瘤外科，沈阳110001）

目的研究远端上游元件结合蛋白1（FUBP1）在胃癌中的表达，探讨其对胃癌细胞增殖侵袭能力的影响。方法采用实时PCR检测FUBP1基因在胃癌组织中的表达。采用单因素方差分析分析FUBP1基因表达与胃癌临床病理因素的相关性。构建FUBP1基因表达沉默载体pS-FUBP1并转染SGC7901细胞，实时PCR检测转染效果。采用CCK8法及Transwell法检测FUBP1基因表达沉默对于SGC7901细胞的增殖和侵袭能力的影响。结果FUBP1基因在胃癌组织中表达显著上调，且随着分化水平的降低、浸润深度和转移淋巴结数量的增加，胃原发癌中FUBP1基因表达明显增高。pS-FUBP1载体能够显著沉默FUBP1基因的表达。FUBP1表达沉默的SGC7901细胞的增殖及侵袭能力下调明显。结论FUBP1基因在胃癌中高表达，与胃癌的发生进展相关，沉默其表达能够抑制胃癌细胞的增殖和侵袭能力。

胃癌；远端上游元件结合蛋白1；增殖；侵袭

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，发病率高居各类肿瘤之首［1］。胃癌的治疗策略是以手术为主结合放化疗的综合治疗，但部分中晚期患者的预后不良，治疗效果不佳，因此深入探究胃癌发生和进展的分子机制，寻找效果更佳、特异性更好的治疗靶点和方法是胃癌研究的重点。人远端上游元件结合蛋白（far upstream element binding protein 1，FUBP1）是在研究原癌基因c-myc时发现的远端上游元件结合蛋白，与FUBP2和FUBP3共同组成FUBP家族，亦属于单链DNA结合家族［2］。FUBP1基因在多种人体组织中存在广泛的表达，与细胞增殖和凋亡相关因子关系密切［3-4］。目前发现FUBP1基因在多种肿瘤组织中存在表达和功能的异常，其高表达与多种肿瘤的预后不良相关［5-7］。本研究拟检测FUBP1基因在胃癌中的表达，明确其表达与胃癌发生进展的相关性，并探讨FUBP1对胃癌细胞增殖和侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象：选择2013年至2015年于大连医科大学附属第二医院肿瘤外科住院的胃癌患者71例，其中，男39例，女32例；年龄43～72岁，中位年龄61岁。患者临床资料完整，术前均未接受放疗和化疗。本研究获得患者的知情同意。人胃癌SGC7901细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.1.2 主要试剂：Trizol提取试剂及转染试剂Lipofectamine 3000购自美国ThermoFisher公司，荧光定量PCR检测试剂盒购自日本TaKaRa公司，引物合成及FUBP1沉默载体（pS-FUBP1）的构建由上海生工公司完成，FUBP1抗体购自美国Abcam公司，CCK8试剂盒及Western blotting相关试剂购自上海碧云天生物技术有限公司，Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 实时PCR：Trizol法提取组织标本总RNA，逆转录成cDNA。以GAPDH为内参基因，按照试剂盒说明书扩增FUBP1基因。FUBP1上游引物序列为5’-GATGGGACAACACCCGAAAG-3’，下游引物序列为5’-CCAGTTGCCTTGACCTCTAC-3’。所得实验数据应用比较Ct值法，即2-ΔΔCt法进行结果分析［6］。

1.2.2 细胞转染及分组：将SGC7901细胞接种在6孔板中（5×104/孔），培养24 h。应用Lipofectamine 3000转染试剂转染pS-FUBP1及相应的对照空载体pSilencer，转染操作按照说明书进行。以未转染的SGC7901细胞作为空白对照（control）组，以转染pSilencer的SGC7901细胞为阴性对照（pS-NC）组，以转染pS-FUBP1的SGC7901细胞为FUBP1沉默（pSFUBP1）组。

1.2.3 CCK8法检测细胞增殖能力：将处于对数生长期的SGC7901细胞常规消化、离心后，重悬于无血清的RPMI1640培养基中（密度为1×105/mL）。将细胞悬液接种于96孔板中，每孔100 μL。每孔加入CCK-8试剂10 μL，37℃孵育2 h，用酶标仪于490 nm处测定吸光度（A）值。

1.2.4 Transwell法检测细胞侵袭能力：将处于对数生长期的SGC7901细胞常规消化、离心后，重悬于无血清的RPMI1640培养基中（密度为2×105/mL）。将100 μL细胞悬液加入预铺Martigel胶的Transwell小室的上室，下室加入600 μL含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基100 μL。37℃孵育24 h。取出小室，弃上室内培养基，水化基底膜基，PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min。风干后，0.1%结晶紫染色30 min，轻轻擦去小室膜上表面尚未穿过的细胞。显微镜下随机选取5个高倍镜视野，计数穿膜细胞数，取平均值作为结果。

1.3 统计学分析

每组实验重复5次。应用SPSS 21.0统计软件对数据进行处理。计量资料以x±s表示。FUBP1 mRNA在胃癌与癌旁组织中表达差异的比较分析采用配对t检验，其在胃癌组织不同分组中表达差异的比较分析采用t检验和单因素方差分析；而实验组与对照组中FUBP1mRNA表达和细胞增殖、侵袭能力的比较分析采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌与癌旁组织FUBP1mRNA表达水平的比较

实时PCR结果经比较Ct值法分析进行相对定量，胃癌和癌旁组织之间的ΔΔCt为-1.627。FUBP1在胃癌组织中呈现显著的高表达，为癌旁正常组织中FUBP1表达量的308.87%，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 胃癌组织FUBP1mRNA表达与患者临床病理参数的关系

分化程度低、浸润程度深、转移淋巴结数量多的患者胃癌组织中FUBP1mRNA表达明显升高（P均＜0.01）。患者的性别及癌灶大小对胃癌组织FUBP1mRNA表达均无影响（P均＞0.05）。见表1。

2.3 pS-FUBP1对SGC7901细胞中FUBP1表达的影响

实时PCR检测结果发现，与对照组细胞相比，pS-FUBP1的转染能够显著沉默SGC7901细胞中FUBP1 mRNA的表达（图1），差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.4 FUBP1沉默对SGC7901细胞增殖能力及侵袭能力的影响

表1 根据不同临床信息分组后胃癌组织中FUBP1基因表达的比较分析Tab.1 The com parative analysis of FUBP1 gene expression in gastric cancer a fter grouping w ith different clinical in form ation

图1 pS-FUBP1对SGC7901细胞中FUBP1表达的影响Fig.1 Effect o f pS-FUBP1 on the expression o f FUBP1 in SGC7901 cells

在转染72 h及96 h后，与对照组相比，FUBP1表达沉默的SGC7901细胞的增殖能力明显下调（图2），差异均有统计学意义（P＜0.05）。

Transwell实验中FUBP1表达沉默的SGC7901细胞的穿膜细胞数为13.7±2.3，与对照组相比显著减少（图3），细胞侵袭能力显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

图2 FUBP1沉默对SGC7901细胞细胞增殖能力的影响Fig.2 Effect o f FUBP1 silence on ce ll pro liferation in SGC7901 ce lls

FUBP1基因属于远端上游元件结合蛋白家族的成员，能够与已激活的远端上游元件（far upstream element，FUSE）结合，促进具有FUSE元件的基因转录表达，进而参与细胞的增殖、凋亡及侵袭转移等生物学行为的调节［8-10］。FUBP1基因的表达和功能异常已被证明与多种肿瘤的发生相关，近年来有关报道逐年增加。

图3 FUBP1沉默对SGC7901细胞细胞侵袭能力的影响Fig.3 Effect o f FUBP1 silence on the ce ll invasion in SGC7901 cells

本研究首先检测胃癌及相应癌旁组织中FUBP1mRNA的表达，明确了FUBP1基因在胃癌组织中高表达，提示其可能与胃癌的发生相关。进一步的统计分析显示，FUBP1基因高表达与胃癌的恶性生物学行为相关，随着分化水平的降低、浸润深度和转移淋巴结数量的增加，胃原发癌中FUBP1基因表达明显增高，但患者的性别及癌灶大小对胃癌组织FUBP1mRNA表达均无影响。ZHANG等［11］研究亦发现，FUBP1基因在胃癌中高表达，且与胃癌患者的总生存率、淋巴及远处转移呈显著正相关。这些报道与本研究结果相符，因此推测FUBP1在胃癌的恶性进展及浸润转移中发挥促进作用。但FUBP1基因的表达异常是否参与胃癌细胞的增殖及侵袭等生物学行为的调节目前尚不清楚，亦无相关研究报道。

本研究构建了FUBP1表达沉默载体，转染胃癌SGC7901细胞，结果显示其能够有效地沉默FUBP1基因，进一步的检测发现沉默FUBP1基因能够显著抑制胃癌SGC7901细胞的增殖能力。DING等［8］报道，FUBP1在脑胶质瘤中高表达，且与胶质瘤的高分级和不良预后相关，沉默其表达能够抑制胶质瘤U87MG细胞的增殖。此外，沉默FUBP1基因还能够降低胃癌SGC7901细胞的侵袭能力，这与本研究中组织表达检测结果相符，浸润程度深、转移淋巴结数量多的患者胃癌组织中FUBP1基因表达上调更为显著。上述结果证实FUBP1基因与胃癌相关，在胃癌中作为癌基因发挥作用，沉默其表达能够显著抑制胃癌细胞的增殖及侵袭能力。

综上所述，FUBP1基因在胃癌中发挥癌基因的作用，但其中的具体作用机制尚不清楚，需要进一步深入研究。

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（编辑王又冬）

Expression of Far Upstream Element Binding Protein 1 in Gastric Cancer and Its Effect on Proliferation and Invasion of Gastric Cancer Cells

LI Dan1，HUANG Baojun2，ZHAO Danyi1

（1.Department of Oncology，Affiliated Second Hospital，Dalian Medical University，Dalian 116027，China；2.Department of Surgical Oncology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To investigate the expression of far upstream element binding protein 1（FUBP1）gene in gastric cancer，and analyze its effect on proliferation and invasion of gastricc cancer cells.Methods The expression of FUBP1 in gastric cancer tissues was detected by real-time PCR.The relationship between FUBP1 expression and clinic pathological factors of gastricc cancer was analyzed by one-way ANOVA.The silence vector for FUBP1 was constructed and transfected into gastricc cancer SGC7901 cells，and the transfected effects were then detected by real-time PCR.The influence of FUBP1 silence on cell proliferation and invasion in SGC7901 cells were detected by CCK8 method and Transwell assay.Results FUBP1 expression was increased markedly in gastricc cancer tissues.Following the depressing of differentiation and the increase of invasion depth and metastatic lymph nodes，the FUBP1 expression was up-regulated in primary gastric carcinoma significantly.The pS-FUBP1 vector could silence the FUBP1 expression in SGC7901 cells.FUBP1 silence inhibited SGC7901 cell proliferation amd invasion.Conclusion FUBP1 was high-expressed in gastricc cancer，and related with genesis and progress of gastric cancer，silence of FUBP1 expression can inhibit the cell proliferation and invasion in gastric cancer cells.

gastric cancer；FUBP1；proliferation；invasion

R735.2

A

0258-4646（2017）07-0587-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.07.003

国家自然科学基金（81272716）

李丹（1979-），女，副主任医师，博士.

赵丹懿，E-mail：danyizhao2000@163.com

2016-07-25

网络出版时间：