白藜芦醇对链脲霉素诱导的糖尿病大鼠神经病理性疼痛的作用

刘晓颖，姚俊洁，刘文

（大连医科大学附属第一医院1.老年医学科；2.内分泌科，辽宁大连116011）

白藜芦醇对链脲霉素诱导的糖尿病大鼠神经病理性疼痛的作用

刘晓颖1，姚俊洁2，刘文1

（大连医科大学附属第一医院1.老年医学科；2.内分泌科，辽宁大连116011）

目的探讨白藜芦醇在链脲霉素（STZ）诱导的糖尿病大鼠神经病理性疼痛中的作用机制。方法通过STZ诱导糖尿病大鼠模型，预先腹腔内注射白藜芦醇（40 mg/kg）。在注射白藜芦醇前和注射后1～4周对大鼠进行机械、冷和热痛觉过敏刺激，同时检测大鼠背根神经节（DRG）中TRPA1和TRPM8的表达。结果白藜芦醇能明显抑制STZ引起的机械和冷痛觉过敏，但是对热痛觉过敏没有作用。STZ注射增加大鼠DRG神经元中TRPM8的表达（P＜0.05），但不影响TRPA1的表达（P＞0.05）。白藜芦醇能降低STZ引起的DRG神经元中的TRPM8表达水平（P＜0.05）。结论白藜芦醇对STZ引起的糖尿病大鼠有抗痛觉超敏作用，可能与DRG中的TRPM8表达相关。

白藜芦醇；链脲霉素；糖尿病；大鼠；神经病理性疼痛

在Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病患者中，糖尿病神经病理性疼痛是最常见的症状［1］。然而却没有一种有效的治疗长期持续慢性疼痛的方法。系统性注射链脲霉素（streptozotocin，STZ）对胰岛β细胞有细胞毒性［2］，STZ诱导Ⅰ型糖尿病是一种研究糖尿病病理模型。白藜芦醇（3，5，4’-trihydroxystilbene，resvera-trol）是一种天然多酚化合物，主要来源于花生、葡萄（红葡萄酒）、虎杖、桑椹等植物。白藜芦醇主要用于预防心血管疾病和癌症，具有抗衰老作用［3-4］。近期有研究［5-7］报道白藜芦醇能够减轻神经病理性疼痛。有研究［8］发现白藜芦醇能够通过激活脊髓中的去乙酰化酶1（sirtuin-1，SIRT1）降低神经病理性疼痛。本研究通过STZ诱导建立糖尿病大鼠模型，探讨白藜芦醇对糖尿病大鼠神经病理性疼痛的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

21只SD大鼠（180～200 g，雄性）购于大连医科大学实验动物中心，室温饲养，12 h照明/12 h黑暗，水与鼠粮自由饮用。动物在实验前至少要适应实验室环境2 h。动物使用遵照大连医科大学动物管理委员会要求。将大鼠随机均分为3组：正常组（腹腔注射生理盐水）、STZ组［腹腔注射STZ（60 mg/kg）］、白藜芦醇+STZ组［腹腔注射STZ（60 mg/kg），30 min后腹腔注射白藜芦醇（40 mg/kg），RS组］。

1.2 糖尿病大鼠模型建立

使用生理盐水配置STZ溶液，按照60 mg/kg剂量腹腔注射大鼠。每周称量体质量，取大鼠尾静脉血，使用血糖仪（HEA-214，美国OMRON公司）测量大鼠血糖。血糖浓度＞240 mg/dL收入组，认为造模成功。

1.3 大鼠行为学测试

在大鼠STZ注射前及注射后1～4周进行行为学实验。

1.3.1 机械痛敏反应：检测大鼠左后足对Von Frey丝（直径200 μm）刺激的缩足反应，使用机械缩足阈值衡量机械痛敏反应。大鼠放置在一个10 cm×10 cm×15 cm的透明玻璃屋中，底部是金属网（0.5 cm× 0.5 cm）。当大鼠适应环境30 min后，采用电子Von Frey测痛仪测定。用Von Frey丝垂直刺激大鼠足底，逐渐增加刺激的强度，当大鼠后足突然缩足、扬足或舔足反应为阳性，每次刺激间隔10 min，每只大鼠重复测量5次。取5次平均值作为缩足反射机械刺激阈值（paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）。

1.3.2 热超敏反应：用后足热缩腿阈值（the paw thermal withdrawal latency，PWL）来测量热超敏。将大鼠单独放置于底部为0.22 mm玻璃的透明笼（20 cm×20 cm×40 cm）中，在安静环境下适应30 min后，使用热辐射疼痛刺激器（BME-410C，天津伯尔尼科技有限公司）照射大鼠后足底，大鼠产生缩足、扬足或舔足反应为阳性停止照射，记录照射持续时间为缩足反射热辐射潜伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）。每只大鼠重复测量5次，间隔＞5 min，取平均值作为PWTL。为避免给大鼠足底皮肤造成损伤，设置最高阈值为20 s。

1.3.3 冷刺激反应：使用丙酮法，将一滴丙酮轻轻滴于大鼠左后足。一共进行5次，每次间隔5 min。大鼠对丙酮刺激所产生的快速缩腿反应作为阳性结果。计算缩腿反应的次数。＞2次认为大鼠对冷痛觉过敏。

1.4 Western blotting检测大鼠背根神经节（dorsal root ganglia，DRG）神经元中TRPA1、TRPM8表达

所有蛋白取自大鼠L4和L5的DRG。每个样品总蛋白30 μg，使用10%的SDS-PAGE进行电泳，在4℃转膜到PVDF上，经过3次TBST（20 mmol/L Tris-Cl，pH 7.5，0.15 mol/L NaCl，0.05%Tween-20）冲洗，用含10%脱脂牛奶的TBST封闭1 h，然后分别一抗TRPA（1∶1 000，美国Abcam公司）和TRPM8（1∶1 000，美国Abcam公司）4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，使用发光试剂盒（英国ECL kit公司）进行信号检测。所有实验使用等量蛋白进行β-actin（1∶1 000，美国Sigma公司）检测。TRPA1、TRPM8和βactin的特异性信号用Image J（美国NIH公司）软件分析。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠行为学结果比较

结果显示，大鼠在进行药物注射前对机械刺激的缩腿反射基础阈值是21.5 g。注射STZ后，STZ组大鼠的机械缩腿阈值明显高于正常组（P＜0.05），并表现为时间依赖性。RS组大鼠的机械缩腿阈值1～4周分别为20.5 g、19 g、19.5 g、20 g。RS组与STZ组比较，STZ组大鼠2～4周的机械缩腿阈值明显减少（P＜0.05）。在注射STZ前30 min，腹腔注射40 mg/kg白藜芦醇能够明显抑制STZ所引起的机械痛觉过敏。见图1A。热刺激反应结果显示，与正常组比较，STZ组大鼠2～4周对热刺激的缩腿反射时间明显减少（P＜0.01）。RS组大鼠的热刺激的缩腿反射时间1～4周分别为12 s、6 s、5 s、7 s。RS组与正常组比较，RS组大鼠2～4周的热刺激的缩腿反射时间缩短（P＜0.01）。腹腔注射白藜芦醇不能改变STZ引起的热痛觉过敏（图1B）。冷刺激反应结果显示，与正常组比较，STZ组大鼠1周后对冷刺激的缩腿反射次数明显增加（P＜0.05），持续到第4周。RS组与STZ组比较，RS组大鼠2～4周对冷刺激的缩腿反射次数明显减少（P＜0.05）。大鼠腹腔注射白藜芦醇能明显抑制STZ引起的冷痛觉过敏（图1C）。

2.2 大鼠DRG中TRPA1和TRPM8蛋白的表达

结果显示，注射STZ对大鼠DRG中TRPA1蛋白的表达没有影响，TRPM8蛋白表达在4周后明显增加，提前注射白藜芦醇能够抑制TRPM8蛋白表达，见图2。

图1 各组大鼠对机械与温度刺激所产生的缩足反应比较Fig.1 Com parison o f the w ithd rawal response to m echanical and therm al stimu li in STZ-induced diabetic rats

图2 各组大鼠DRG中TRPA1和TRPM8蛋白表达比较Fig.2 TRPA1 and TRPM 8 protein expression levels in the dorsal root ganglia of rats

3 讨论

白藜芦醇能够减轻神经病理性疼痛［5-7］，但是关于其对机械痛敏与温度痛敏的研究并不多见。TRPA1与TRPM8都是能够被冷温度激活的瞬间受体电位离子通道。本实验结果发现，STZ会引起大鼠对机械与温度的痛觉异常。通过提前注射白藜芦醇能够抑制机械与冷痛觉异常，而对热痛觉异常没有作用。REGE等［3］研究发现白藜芦醇通过对细胞内的氧化应激反应进行调控，从而对阿尔兹海默小鼠起到神经保护作用。因此，白藜芦醇有可能在DRG的神经元细胞中具有相似的功能，调控氧化应激反应，从而保护DRG中的神经元细胞，防止神经病理性疼痛的发生。

白藜芦醇通过降低NF-κBp65乙酰化能够缓解L5神经结扎大鼠的神经病理性疼痛［9］。白藜芦醇通过抑制MIF/ERK信号通路治疗Ⅰ型复杂性区域疼痛综合征［10］。白藜芦醇是一种天然的抗氧化剂，具有抗炎、抗动脉硬化和抗心律失常的作用。本研究结果显示，STZ注射可以引起大鼠DRG中TRPM8蛋白的表达增加，但是不影响TRPA1蛋白的表达。白藜芦醇有可能通过增加TRPM8蛋白的表达，从而调控下游的信号通路，引起ERK-κBp65的磷酸化，发挥缓解神经病理性疼痛的作用，这与以往研究［9-10］结果一致。

综上所述，白藜芦醇能够减轻STZ所引起的糖尿病机械痛与冷痛敏感，但对STZ所引起的糖尿病热痛没有作用。白藜芦醇能够作用TRPM8通道，缓解糖尿病大鼠神经病理性疼痛，本实验为临床糖尿病患者治疗疼痛提供了一个新的作用靶点，有可能指导临床用于缓解糖尿病患者的疼痛。

［1］ZYCHOWSKA M，ROJEWSKA E，PRZEWLOCKA B，et al.Mechanisms and pharmacology of diabetic neuropathy-experimental and clinical studies［J］.Pharmacol Rep，2013，65（6）：1601-1610.

［2］YAYI H，YEDA X，HUAXIN W，et al.Toll-like receptor 7 involves the injury in acute kidney ischemia/reperfusion of STZ-induced diabetic rats［J］.Acta Cir Bras，2016，31（7）：448-455.DOI：10.1590/ S0102-865020160070000004.

［3］REGE SD，GEETHA T，GRIFFIN GD，et al.Neuroprotective effects of resveratrol in Alzheimer disease pathology［J］.Front Aging Neurosci，2014，6：218.DOI：10.3389/fnagi.2014.00218.

［4］BASTIANETTO S，MENARD C，QUIRION R.Neuroprotective action of resveratrol［J］.Biochim Biophys Acta，2015，1852（6）：1195-1201.DOI：10.1016/j.bbadis.2014.09.011.

［5］CHENG W，ZHAO Y，LIU H，et al.Resveratrol attenuates bone cancer pain through the inhibition of spinal glial activation and CX3CR1 upregulation［J］.Fundam Clin Pharmacol，2014，28（6）：661-670.DOI：10.1111/fcp.12084.

［6］MAIA H，HADDAD C，PINHEIRO N，et al.Advantages of the association of resveratrol with oral contraceptives for management of endometriosis-related pain［J］.Int J Womens Health，2012，4：543-549.DOI：10.2147/IJWH.S36825.

［7］YIN Q，LU FF，ZHAO Y，et al.Resveratrol facilitates pain attenuation in a rat model of neuropathic pain through the activation of spinal Sirt1［J］.Reg Anesth Pain Med，2013，38（2）：93-99.DOI：10.1097/AAP.0b013e3182795b23.

［8］WUERTZ K，QUERO L，SEKIGUCHI M，et al.The red wine polyphenol resveratrol shows promising potential for the treatment of nucleus pulposus-mediated pain in vitro and in vivo［J］.Spine（Phila Pa 1976），2011，36（21）：E1373-E1384.DOI：10.1097/BRS.0b013 e318221e655.

［9］王依慰，刘清珍，陈春龙，等.白藜芦醇通过降低NF-κBp65乙酰化缓解大鼠神经病理性疼痛［J］.中国药理学通报，2016，32（1）：89-93.

［10］石小乐.白藜芦醇抑制MIF/ERK信号通路干预复杂性区域疼痛综合征1型的实验研究［D］.南昌大学，2015.

（编辑武玉欣）

Effects of Resveratrol on Streptozotocin-induced Diabetic Neuropathic Pain in Rats

LIU Xiaoying1，YAO Junjie2，LIU Wen1

（1.Department of Geriatric Medicine，The First Affiliated Hospital，Dalian Medical University，Dalian 116011，China；2.Department of Endocrinology，The First Affiliated Hospital，Dalian Medical University，Dalian 116011，China）

Objective To investigate the effects of resveratrol on diabetic neuropathic pain induced by streptozotocin（STZ）in rats.Methods The subjects were pretreated with resveratrol（40 mg/kg）intraperitoneally，30 min before an intraperitoneal injection of STZ（60 mg/kg）. Mechanical and cold allodynia were tested before and 1 to 4 weeks after the drug administration.Thermal hyperalgesia was also investigated.In addition，the transient receptor potential（TRP）Ankyrin 1（TRPA1）and TRP melastatin 8（TRPM8）expression levels in the dorsal root ganglia（DRG）were evaluated.Results Pretreatment with resveratrol significantly inhibited STZ-induced mechanical and cold allodynia，but not thermal hyperalgesia.The STZ injection increased TRPM8 expression levels（P＜0.05），but not TRPA1（P＞0.05）expression levels，in the DRG. Pretreatment with resveratrol decreased STZ-induced TRPM8 expression levels in the DRG（P＜0.05）.Conclusion The results demonstrated that pretreatment with resveratrol had strong anti-allodynic effects in STZ-induced diabetic rats，which might be associated with TRPM8 located in the DRG.

resveratrol；streptozotocin；diabetics；rat；neuropathic pain

R587.1

A

0258-4646（2017）07-0591-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.07.004

国家自然科学基金（81300671）

刘晓颖（1981-），女，主治医师，硕士.

刘文，E-mail：liuwen197701@163.com

2016-12-12

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