C 20or f54抑制食管癌细胞增殖并促进其凋亡

马良，徐延钧，李丹，郭步平，郭旭霞*

（长治医学院附属和平医院1检验科，2普外三科，3生殖遗传中心，长治 046000）

C 20or f54抑制食管癌细胞增殖并促进其凋亡

马良1，徐延钧2，李丹3，郭步平1，郭旭霞1*

（长治医学院附属和平医院1检验科，2普外三科，3生殖遗传中心，长治 046000）

目的观察过表达C20orf54对食管癌细胞周期和凋亡的影响，探讨C20orf54基因在食管癌发生、发展中的作用。方法应用免疫组织化学染色方法检测C20orf54蛋白在食管癌组织和癌旁正常组织中的表达；应用MTT法和流式细胞术检测过表达 C20orf54对食管癌细胞系EC9706细胞增殖能力、细胞凋亡与细胞周期的影响。结果C20orf54在食管癌组织中免疫反应性显著低于癌旁正常组织。稳定转染表达C20orf54的EC9706细胞生长明显受抑制，且G0/G1期细胞积聚，周期阻滞，细胞凋亡增多。结论C20orf54 基因可能参与食管癌的生长调控，食管癌的发生与C20orf54 基因的表达有关。

食管癌； C20orf54基因；细胞周期；细胞凋亡

C20orf54基因是人类核黄素转移蛋白2基因（human ribofavin transporter 2，hRFT2），也称为SLC52A3基因，是近几年新发现的与食管癌发病相关基因。该基因定位于20p13，其mRNA全长2716 bp（NM_033409.3），共有5个外显子，编码一个由469个氨基酸组成的开放阅读框蛋白。C20orf54被认为在人体吸收核黄素过程中起重要作用。最近有研究发现，C20orf54基因中多个位点的突变会导致一种罕见的神经退行性疾病Brown-Vialetto-Van Laere syndrome（BVVLS）的发生[1-3]，这些突变导致C20orf54对细胞膜转运定位核黄素的能力失败，进而体内核黄素水平下降。在临床治疗中补充核黄素可以对其中一些BVVLS病人起到很好的疗效[4]；将核黄素应用于临床放化疗，可有效缓解黏膜炎症，对黏膜增生恶化有很好的防治作用[5]。C20orf54基因编码的蛋白含有11 个跨膜区，可以特异高效将核黄素转运到细胞中，在食管癌高发区实施核黄素强化盐可以显著增加机体内的核黄素水平，延缓和逆转食管癌前病变的发展进程，降低食管癌发病风险[6]。然而，C20orf54在肿瘤，特别是在食管癌发生发展中的作用及分子机制尚不清楚。本研究在检测食管癌组织中C20orf54表达水平的基础上，分析了过表达C20orf54对食管癌细胞株EC9706细胞生长、细胞周期及凋亡等细胞生物学行为的影响，初步探讨C20orf54在食管癌发生发展中的作用。

材料与方法

1 主要材料和试剂

临床标本取自2014年1月至2015年3月在长治医学院附属和平医院住院期间经手术病理证实、术前均未经放疗、化疗及其他治疗的58例食管癌患者的食管鳞癌组织及癌旁（距肿瘤边缘＞3cm）的正常食管黏膜组织，其中男性32例，女性26例，年龄45～70岁。食管鳞癌细胞株EC9706购自中科院北京肿瘤细胞库。

C20orf54基因引物设计及构建过表达载体pCDNA-C20orf54-Flag由上海吉凯基因化学技术有限公司提供。抗体：兔抗人C20orf54多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司； HRP标记的山羊抗兔IgG购自武汉博士德生物公司。Lipofectam ine 2000 转染试剂购自美国Invitrogen公司。

2 免疫组织化学染色

组织标本经4%的多聚甲醛固定液固定、石蜡包埋、切片（厚度4μm），微波修复法进行进行抗原修复，取500 m l枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）于微波盒中，加热直至沸腾，切片脱蜡入水后置于耐高温塑料切片架上。放人己沸腾的缓冲液中，微波继续处理15m in，取出微波盒冷却至室温，取出玻片。先用蒸馏水冲洗2次，随后，PBS洗2～3次（各5min），3% H2O2室温静置10m in，兔抗C20orf54多克隆抗体（1:500）室温静置1h，PBS洗2～3次（各5min），HRP标记的山羊抗兔IgG（1:500）37℃孵育1h，PBS洗3次（各5m in），DAB显色10m in，PBS洗2次各5m in，苏木素复染2m in后盐酸酒精分化，自来水冲洗10m in，脱水，透明、封片后镜检。观察10个高倍视野，Image Proplus软件统计阳性染色标记细胞的平均光密度。

3 细胞转染和稳定表达C20orf54细胞株的建立

食管癌细胞株EC9706用含10%胎牛血清的DMEM培养液于37℃、5% CO2条件下培养，隔日换液，取对数生长期细胞备用。转染前 24 h 将细胞接种至 6 孔板，接种量1×106个细胞/孔，转染时汇合度达90%以上，载体与脂质体比例为1μg:3μl，空白对照组（EC9706）只转染Lipofectam ine 2000试剂，阴性对照组（EC9706/pCDNA）转染空载体pCDNA-Flag，实验组（EC9706/C20orf54-Flag）转染质粒pCDNA-C20orf54-Flag。转染4～6h后，细胞换含10%胎牛血清的培养液继续培养；转染24h后更换含G418（200μg/m l）的培养基，继续培养两周，待对照细胞全部死亡时基本已得到G418抗性细胞的稳定克隆。挑选单个细胞的阳性克隆至24孔板继续筛选培养，筛选出的稳定株分别为阴性对照组EC9706/pCDNA和实验组EC9706/C20orf54-Flag。

4 M TT法检测细胞增殖能力

3组稳定细胞传代培养24h后，分别接种于96孔板（1×103细胞/孔），每组12孔，分别于24h，48h，72h 3个时间点加入20μl MTT试剂，37℃、5% CO2继续孵育4h，小心吸出培养液，每孔加入100μl DMSO，充分溶解结晶，429nm波长下检测吸光OD值。

5 流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡

细胞周期检测：稳定细胞在6孔板内培养48h后，用不含EDTA的0.25%胰酶消化细胞，2000 r/m in离心5m in，弃上清。用预冷的1×PBS洗涤收集的细胞3次，2000r/m in，5m in，弃上清，以0.5 m l 1×PBS重悬细胞，快速加入3.5 m l 70%预冷的乙醇，吹打均匀，4℃储存过夜。 离心乙醇固定过的细胞，弃上清，1×PBS洗涤细胞3次去除残留的乙醇，用含有0.2mg RNase A的1m l PI/Triton X-100染色液（20 μg PI/0.1% Triton X-100）重悬细胞， 37℃避光孵育15m in后经流式细胞仪检测，每个实验重复3次。

Annexin-V-FITC 和 PI双染法检测凋亡：取稳定细胞培养48h、72h两个时间点的3组细胞，用不含EDTA的0.25%的胰酶消化细胞，2000r/m in离心5m in，弃上清；用1×PBS洗涤细胞2次，2000r/min离心5m in，弃上清；加入500μl Binding Buf er悬浮细胞后，加入5μl Annexin V-EGFP混匀，再加入5 μl PI，混匀；室温避光10m in，流式细胞仪检测细胞凋亡，每个实验重复3次。

6 统计学分析

结 果

1 食管癌组织中C20orf54免疫反应性降低

对58例食管癌组织和癌旁正常组织C20orf54进行免疫组织化学检测显示， C20orf54免疫反应阳性产物主要定位在食管鳞状上皮细胞的胞质中（图1）。Image Proplus分析结果显示，癌旁组织C20orf54免疫反应产物的平均光密度为0.30±0.04，而食管癌组织C20orf54免疫反应产物的平均光密度为0.15±0.07，食管癌组织中C20orf54免疫反应性明显降低。

图1 食管癌组织C20orf54的免疫组织化学检测。 A，食管癌组织；B，癌旁组织；箭头示C20orf54免疫反应产物；比例尺，100μm；C，食管癌组织C20orf54免疫反应性的统计学分析；*，与癌旁组织比较，0.01＜P＜0.05Fig. 1 Immunohistochem ical detection for C20orf54 expression in esophageal cancer tissue. A, esophageal cancer tissue; B, adjacent tissue; arrows indicating C20orf54 immunoreactive products; scale bar, 100μm; C, statistical analysis of C20orf54 immunoreactivity in esophageal cancer tissue; *, 0.01＜P＜0.05, compared w ith adjacent tissue

2 过表达C20orf54抑制EC9706细胞增殖

为了明确C20orf54对食管癌细胞生长增殖的影响，用真核细胞表达质粒pCDNA-C20orf54-Flag转染食管癌细胞株EC9706细胞，经G418筛选后获得稳定表达C20orf54的细胞株。用MTT分析检测稳定转染细胞株过表达C20orf54对EC9706细胞增殖能力的影响，结果显示：与空白对照组相比，阴性对照组细胞增殖能力无明显差异，而过表达C20orf54的细胞增殖能力显著降低（表1），表明C20orf54对食管癌细胞的增殖具有抑制作用。

表1 过表达C20orf54对EC9706细胞增殖的影响Tab. 1 The ef ect of C20orf54 overexpression on EC9706 cell proliferation

3 过表达C20orf54使EC9706细胞周期阻滞在G0/ G1期

为了明确C20orf54是否调控食管癌的细胞周期，应用流式细胞术检测了过表达C20orf54对EC9706细胞周期的影响。结果显示：与空白对照组和阴性对照组比较，过表达C20orf54的细胞，其G0/G1期细胞显著增多，而S期细胞显著减少，G2/M期无显著变化（图2，表2），由此表明，过表达C20orf54使EC9706细胞周期阻滞在G0/G1期，具有明显抑制细胞增殖作用。

图2 过表达C20orf54对EC9706细胞周期的影响。A，空白组；B，阴性对照组；C，实验组Fig. 2 The ef ect of C20orf54 overexpression on EC9706 cell cycle. A, blank control group; B, negative control group; C, experimental group

表2 过表达C20orf54对EC9706细胞周期的影响Tab. 2 The ef ect of C20orf54 overexpression on EC9706 cell cycle

4 过表达C20orf54促进EC9706细胞凋亡

应用流式细胞术检测稳定转染C20orf54的EC9706细胞凋亡情况，结果显示：与空白对照组相比，阴性对照组细胞凋亡率无明显差异，而实验组细胞凋亡率显著升高（图3，表3）。

图3 过表达C20orf54对EC9706细胞凋亡的影响。A，空白组；B，阴性对照组；C，实验组Fig. 3 The ef ect of C20orf54 overexpression on EC9706 cell apoptosis. A, blank control group; B, negative control group; C, experimental group

讨 论

食管癌在我国高发，是恶性肿瘤相关死亡的重要原因，探究其病因十分重要。C20orf54在人小肠粘膜上皮摄取核黄素的过程中发挥重要作用[6]，核黄素，即维生素B12，一种水溶性维生素，需要从体外摄取。在人体内以黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）形式存在，参与体内氧化还原反应，调节细胞能量代谢，维持细胞内稳态，参与体内很多调控细胞生命活动的化学反应，如碳水化合物、氨基酸、脂肪酸的氧化代谢等。核黄素需要从体外摄入，人体自身不能合成，C20orf54负责体内核黄素的吸收和转运。

表3 过表达C20orf54对EC9706细胞凋亡的影响（%，±s）Tab. 3 The ef ect of C20orf54 overexpression on EC9706 cell apoptosis (%,±s)

表3 过表达C20orf54对EC9706细胞凋亡的影响（%，±s）Tab. 3 The ef ect of C20orf54 overexpression on EC9706 cell apoptosis (%,±s)

*，与空白组比较，0.01＜P＜0.05；#与阴性对照组比较，0.01＜P＜0.05*, 0.01＜P＜0.05, compared w ith blank；#, 0.01＜P＜0.05, compared w ith negative control

组别Group Apoptotic rate (%) 48 h 72 h空 白 组Blank control group 5.20±0.74 5.82±1.01阴性对照组Negative control group 5.63±0.82 6.27±0.87实 验 组Experimental group 13.04±1.53*#14.26±1.77*#

在食管癌高发区进行的流行病学调查和实验研究表明，核黄素代谢异常是食管癌发生的重要背景，食管癌高发区居民膳食中普遍存在缺乏核黄素的现象。核黄素缺乏可引起皮肤、口腔及食道的炎症，进而引起食管上皮细胞萎缩、增生等病理变化；核黄素缺乏还会增加食管上皮对亚硝胺等致癌物质的敏感性，间接促进食管癌的发生发展[7,8]。

本实验观察到C20orf54在食管鳞癌组织中表达有所下降。MTT实验发现，稳定过表达C20orf54的食管癌细胞株EC9706细胞生长明显受抑；流式细胞术发现，稳定过表达C20orf54的EC9706细胞G0/G1期细胞显著增多，而S期细胞显著减少，G2/M期没有显著变化，且细胞凋亡率明显增加。本研究结果进一步提示了 C20orf54 基因可能参与食管癌的生长调控。C20orf54基因可抑制细胞生长并促进细胞凋亡，在食管癌的发生发展中扮演着抑癌基因的角色。该研究为进一步寻找食管癌致病因素，建立食管癌高危人群筛查和早期诊断的方法，明确食管癌发生机制提供了科学依据。

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C20orf54 inhibits the p roliferation of EC9706 cells and induces their apoptosis

Ma Liang1, Xu Yanjun2, Li Dan3, Guo Buping1, Guo Xuxia1*
(1Clinical Laboratory,2General Surgery Clinic Ⅲ,3Reproductive Medicine Center, Peace Hospital of Changzhi Medical College, Changzhi 046000, China)

ObjectiveTo study the ef ect of C20orf54 overexpression on the cell cycle and apoptosis of EC9706 cell line and to investigate the role of C20orf54 in the occurrence and development of esophageal carcinoma.MethodsThe expression of C20orf54 in esophageal cancer tissue and normal esophageal mucosa was detected by immunohistochem ical staining. The ef ect of C20orf54 overexpression on the proliferative ability, apoptosis and cell cycle of esophageal cancer cell line EC9706 was detected by MTT and fow cytometry.ResultsImmunohistochem ical staining results showed that C20orf54 level was lower in esophageal cancer tissue than in adjacent tissue. MTT and fow cytometry results showed that for those EC9706 cells transfected w ith and stably expressing C20orf54, the grow th was signif cantly inhibited, G0/G1 cells accumulated, the cell cycle was arrested, and apoptosis increased.ConclusionsC20orf54 gene may be involved in the regulation of esophageal cancer development. Esophageal carcinogenesis is related to the expression of C20orf54 gene.

Esophageal carcinoma; C20orf54 gene; cell cycle; apoptosis

R361

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850.2017.03.009

2016-12-07

2017-05-22

长治医学院科技创新团队（CX201405）

马良，女（1985年），回族，主管检验师

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：305983534@qq.com