吸入细颗粒物在小鼠体内多器官分布及其组织损害的组织化学检测

马叶冰，程培培，吕新，袁廷国，向菲

（1华中科技大学同济医学院基础医学院，武汉430030；2华中科技大学同济医学院附属协和医院呼吸内科，武汉 430022）

吸入细颗粒物在小鼠体内多器官分布及其组织损害的组织化学检测

马叶冰，程培培1，吕新#，袁廷国Δ，向菲2*

（1华中科技大学同济医学院基础医学院，武汉430030；2华中科技大学同济医学院附属协和医院呼吸内科，武汉 430022）

目的探讨我国大气污染的主要成分细颗粒物（PM 2.5）被吸入后在机体内的分布情况。方法选用碳粉颗粒制成悬液，于雾化箱中超声雾化使小鼠吸入碳粉颗粒，6周后取小鼠脏器并行HE染色明确碳粉颗粒的体内分布，Masson三联染色检测肺组织胶原沉积，肺组织免疫荧光染色检测F4/80和TGF-β1蛋白的免疫反应性表达。结果吸入体内的碳粉颗粒主要沉积于肺泡及肺间质中，并诱导肺泡巨噬细胞在肺内聚集，以及诱导肺组织胶原纤维沉积和TGF-β1表达增强；全身脏器中，脾脏内有较多的碳粉沉积，其他脏器如心、肝、小肠内也见少许分布。结论可吸入的细颗粒物主要分布于肺，引起肺泡腔变小、肺间隔增厚和胶原纤维沉积，并可以到达全身其他脏器，可能造成全身性危害。

细颗粒物；分布；呼吸

目前，我国大气污染严重。2016年5月20日，我国政府公布的《2015年中国环境状况公报》显示，目前我国主要的空气污染物是细颗粒物（PM 2.5）、臭氧和可吸入颗粒物（PM 10），以它们为首要污染物而导致空气质量超标的天数分别占66.8%、16.9%和15.0%[1]。其中，PM 2.5被吸入后，可到达呼吸系统的终端--肺泡，并能被吸收入血。所以，研究者们格外重视对PM 2.5的研究。流行病学分析证实PM 2.5与糖尿病、哮喘和高血压等多种疾病的发生密切相关[2]。然而，PM 2.5被吸入机体后，究竟可以到达哪些部位，对机体究竟有何具体危害作用，此方面的报道尚不多见。为此，我们进行了吸入PM 2.5在体内分布的研究。

材料与方法

1 实验材料

实验动物为C57BL/6J小鼠，购于华中科技大学同济医学院实验动物中心。可吸入细颗粒物选用碳粉颗粒，所用碳粉为日本三菱生产的色素碳黑MA100，颗粒直径24nm。抗鼠F4/80抗体购于Santa Cruz公司，抗鼠TGF-β1抗体购于R&D公司，A lexa Fluor 488标记山羊抗鼠和CY3标记山羊抗鼠购自谷歌生物。

2 碳粉悬液的配制

用无菌生理盐水将碳粉配制成浓度为2000μg/ m l的碳粉悬液，加入超声雾化仪中雾化使用。

3 实验动物分组

雄性、鼠龄8-10周的C57BL/6J小鼠，随机分成正常对照组与碳粉雾化吸入组，每组5只。

4 碳粉雾化方法

将小鼠置于带开放孔的雾化箱中，每天两次（上午、下午各一次）雾化吸入碳粉，雾化剂量每次为50m l碳粉悬液，1h左右雾化完毕。每周一至周五雾化，周六、周天停用，总共持续6周。

5 标本的处理

小鼠于6周雾化结束后处死，立即分离肺、心、肝、脾脏、小肠等器官，用0.1mol/L PB（pH7.4）配制的4%的甲醛固定，石蜡包埋。

6 肺组织切片的伊红染色

将石蜡切片依次经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化，然后用伊红染液染色5m in，再依次经梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。为便于观察碳粉颗粒的分布，未进行苏木素染色染细胞核。用光学显微图像采集系统采集图像。

7 肺组织切片的M asson三联染色

将石蜡切片依次经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化；入重铬酸钾浸泡过夜，水稍洗后用铁苏木素染液染色3min，自来水洗后经盐酸酒精分化；然后用丽春红酸性品红液染色5～10m in，自来水快速漂洗；再经磷钼酸水溶液处理1～3m in后直接用苯胺蓝染液染色3～6m in；1%冰醋酸分化，最后依次经梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。用光学显微图像采集系统采集图像。Masson三联染色检测胶原沉积，蓝色为胶原纤维。

8 肺组织切片巨噬细胞的标志物F4/80和TGF-β1免疫荧光染色

将石蜡切片依次经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、蒸馏水洗涤；用EDTA抗原修复缓冲液（pH8.0）孵育切片进行抗原修复， 经0.01mol/L PBS震荡洗涤3次，每次5m in；加入自发荧光淬灭剂5m in，流水冲洗10m in；3%BSA孵育30m in；滴加小鼠F4/80单克隆抗体（1:50 稀释）或小鼠TGF-β1单克隆抗体（1:20 稀释）， 4°C孵育过夜； PBS洗涤后滴加Alexa CY3标记山羊抗鼠IgG (用于F4/80，1:300稀释) 或Fluor 488标记山羊抗鼠IgG（用于TGF-β1，1:400稀释），避光室温孵育50m in； PBS洗涤后滴加4μg/m l DAPI染液，避光室温孵育10min； 经PBS洗涤后用抗荧光淬灭封片剂封片。激光扫描共聚焦显微成像系统采集图像。

结 果

1 碳粉颗粒在呼吸道中的分布

伊红染色结果显示，碳粉颗粒被小鼠吸入后，可在气管（图1）、支气管壁粘附（图1），有的被巨噬细胞所吞噬，且每个巨噬细胞内可见吞噬的多个碳粉颗粒。到达肺泡的碳粉颗粒，造成肺泡的炎症反应，肺泡内炎症细胞增多、肺泡间隔增宽，碳粉颗粒多数分布于肺泡及肺间质中（图1）。

2 吸入碳粉颗粒诱导肺泡巨噬细胞的聚集

为明确肺泡巨噬细胞与吸入碳粉在肺内分布的关系，我们用免疫荧光染色检测了小鼠活化巨噬细胞标志物F4/80在肺内的表达情况。结果显示，在碳粉颗粒分布的区域（图2），F4/80免疫反应阳性的细胞明显增多（图2），但仅有部分碳粉颗粒分布于F4/80染色阳性的细胞中，这些结果提示，吸入的碳粉颗粒可能诱导了肺泡巨噬细胞的聚集。

3 碳粉吸入促进肺组织中胶原纤维沉积及TGF-β1免疫反应性表达增强

为明确碳粉吸入对肺内胶原纤维沉积的影响，进行了肺组织切片的Masson三联染色，结果显示碳粉吸入使肺组织的胶原沉积明显增多（图3）。

图1 吸入碳粉颗粒在气管、支气管及肺内的分布。箭头示碳粉颗粒所在处；标尺，50μmFig. 1 The distribution of inhaled carbon particles in the trachea, bronchia and lung. Arrows indicate carbon particle deposition; scale bar, 50μm

TGF-β1是细胞增殖和细胞外基质重建的关键生长因子，为进一步分析胶原纤维沉积的可能机制，进行了TGF-β1的免疫荧光染色。与对照组比较，碳粉吸入组TGF-β1表达阳性细胞明显增多，并且主要位于碳粉分布区域（图3）。

4 碳粉颗粒在脾脏的分布

脾脏内部可分为红髓及白髓，碳粉颗粒由呼吸系统进入小鼠体内后，在脾脏有较多分布。碳粉颗粒有的被巨噬细胞吞噬，有的直接散布于脾脏组织中。脾脏组织的形态结构未受到明显影响（图4）。

5 碳粉颗粒在其他脏器的分布

进一步观察碳粉颗粒在其他脏器的分布显示，心肌组织、肝组织及小肠上皮组织中均可见少量碳粉颗粒沉积，碳粉颗粒主要位于巨噬细胞中（图5）。这些脏器的形态结构未发生明显改变。

讨 论

本实验通过雾化碳粉悬液使小鼠吸入细颗粒物，经伊红染色观察，碳粉颗粒主要沉积于肺泡及肺间质中，在呼吸系统内，还可粘附于气管、支气管，并有部分进入气道上皮细胞内。全身脏器中，脾脏内有较多的碳粉沉积，其他脏器包括心、肝、小肠等仅见少许分布。

PM 2.5的来源复杂，主要成分为元素碳、有机碳、硫酸盐、硝酸盐、铵盐等，其中含碳物质所占比例高达40%以上[3]。近年，研究人员分析我国部分地区空气中PM 2.5的构成，其中含碳物质的浓度为19～44μg/m3, 以冬季采暖期间最高[4,5]。所以，研究可吸入性含碳颗粒物的危害有重大意义。因此，我们选取碳粉作为可吸入颗粒进行了相关研究。同时碳粉进入机体后，因其黑色，便于跟踪观察，这也是我们选取碳粉进行实验的原因。

以往的研究证实，直径小于0.1μm的颗粒可以直接进入非巨噬细胞内[6]。为明确碳粉颗粉吸入后在肺内的分布与肺泡巨噬细胞之间的关系，我们进行了活化的小鼠肺泡巨噬细胞标志物F4/80的染色[7]。结果证实，碳粉颗粒沉积区域肺泡巨噬细胞大量聚集，但仅有部分碳粉颗粒分布于F4/80染色阳性的细胞中。究其原因，本研究中使用的碳粉颗粒为24nm，碳粉颗粒除了可以进入巨噬细胞以外，也可以直接进入肺内其它细胞中。另一方面，吞噬了碳粉颗粒的巨噬细胞会破裂、分解，也直接导致了其标志物F4/80的丢失，染色呈阴性。因此，并非所有含碳粉颗粒的细胞均呈F4/80染色阳性。

图2 碳粉吸入对小鼠肺组织中肺泡巨噬细胞分布的影响。 红色为F4/80免疫荧光染色，蓝色为DAPI染色的细胞核；黑色箭头示碳粉颗粒所在处；白色箭头分别示代表性的F4/80阳性肺泡巨噬细胞；标尺，50μmFig. 2 The ef ect of inhaled PM 2.5 on the distribution of alveolar macrophages in mouse lung tissue. Red, immunofuorescence stained F4/80; blue, DAPI stained cell nuclei; black arrows, carbon particle deposition; white arrows, representative F4/80 positive macrophages; scale bar, 50μm

本实验中，碳粉被小鼠吸入后停留于肺组织中，引起了炎症反应，导致肺泡腔变小、肺间隔增厚和胶原纤维沉积，这些改变会导致肺泡通气及气血交换的下降，因而影响机体氧气的交换与吸收。大量研究揭示PM 2.5参与呼吸系疾病如慢性阻塞性肺病[8-10]及哮喘[11-12]的发生和急性加重，而PM 2.5与肺纤维化的关系尚不明确。近些年我国肺纤维化疾病的发病率呈现明显的上升趋势，这可能与环境污染、PM 2.5浓度较高密切相关[13]，但PM 2.5参与肺纤维化的具体机制尚不清。肺纤维化多由肺间质增生、胶原过度沉积所致[14]。本实验研究了碳粉颗粒吸入后小鼠肺间质增生和胶原表达的变化，结果显示碳粉颗粒确实诱导了肺间质的增生，胶原表达增加。TGF-β1是组织增生、促纤维化最重要的生长因子[15]，碳粉颗粒导致了肺组织中TGF-β1的表达增强，提示TGF-β1这一经典的促纤维化因子可能参与了PM 2.5 介导的肺间质增生反应。

脾脏是机体最大的免疫器官，占全身淋巴组织总量的25%，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心。碳粉颗粒经呼吸系统进入血液后，在脾脏有较多分布，主要原因应该是巨噬细胞吞噬碳粉颗粒后转运至脾脏，使碳粉颗粒停留在脾脏内。脾脏内的部分碳粉颗粒不在巨噬细胞中，但呈现聚集状态，可能也是吞噬碳粉颗粒的巨噬细胞已死亡分解而导致的结果。碳粉颗粒在其他脏器，如心、肝、小肠等都可见分布，但是其量少，且大都分布于巨噬细胞中，所观察的切片中，尚未见对这些脏器形态结构造成影响。

图3 碳粉吸入对小鼠肺组织中胶原纤维沉积及TGF-β1免疫反应性表达的影响。绿色，TGF-β1免疫荧光染色；蓝色，DAPI染色的细胞核；黄色箭头，胶原纤维沉积；黑色箭头，碳粉颗粒所在处；白色箭头，代表性的TGF-β1阳性表达；标尺，50μmFig. 3 The ef ect of inhaled PM 2.5 on collagenous fber deposition and TGF-β1 expression in mouse lung tissue. Green, immunof uorescence stained TGF-β1; blue, DAPI stained cell nuclei; yellow arrows, collagenous f ber deposition; black arrows, carbon particle deposition; white arrows, representative TGF-β1 positive expression; scale bar, 50μm

图4 吸入碳粉颗粒在脾脏内的分布。箭头示碳粉颗粒所在处；标尺，50μm。Fig. 4 The distribution of inhaled carbon particles in the spleen. Arrows show carbon particle deposition; scale bar, 50μm.

然而，真实大气污染的PM 2.5中成份复杂，碳粉可以吸附很多有害物质，如重金属、微生物及有毒化合物[16]。其中微生物可导致机体的感染，其他物质进入机体并达到一定的积累量，也会对有关脏器造成损害[17]。所以，PM 2.5除了其作为细颗粒物对机体的物理损伤之外，还因其包含的有害成分导致生物性、化学性等方面的损伤。避免PM 2.5的吸入当然是杜绝其危害的最直接的方法，但是治理空气污染非一日之功，探究PM 2.5在机体的分布及其危害等有明显的现实意义，需要更深入的研究。

图5 吸入碳粉颗粒在心、肝及小肠的分布。箭头示碳粉颗粒所在处；标尺，50μmFig. 5 The distribution of inhaled carbon particles in the heart, liver and small intestine. Arrows show carbon particle deposition; scale bar, 50μm

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H istochem ical detection for the distribution for inhaled particu late m atter 2.5 in mu ltip le organs and the related tissue damage of m ice

Ma Yebing, Cheng Peipei1, Lv Xin3, Yuan Tingguo3, Xiang Fei2*
(1School of Basic Medicine, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China;2Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology)

ObjectiveTo investigate the distribution of particulate matter 2.5 (PM 2.5) inhaled into the body from air pollutants in China. M ethodsM ice were exposed to the ultrasonic aerosol of carbon particle (diameter 24nm) suspension for an hour, tw ice a day for 6 weeks, and then euthanized. the lung, heart, liver, spleen, and intestine were sampled for histological analysis. The distribution of inhaled particles was detected by HE staining; the deposition of collagenous fber was determ ined by Masson staining; the expression of F4/80 and TGF-β1 protein was detected by immunofuorescent staining of the lung tissue.ResultsThe inhaled carbon particles deposited mainly in lung alveoli and mesenchyme and induced alveolar macrophage accumulation, collagenous fber deposition as well as TGF-β1 up-regulation in the lung. Of the other organs, the spleen was found to contain more carbon particles than the rest, while a small amount of carbon deposition was also observed in the heart, liver and small intestine.ConclusionInhaled PM 2.5 distributes mainly in the lung and leads to thickening of interlobular septa and collagenous fber deposition, then narrow ing of alveolar cavity. The particles can also spread into other organs of the body and may cause systematic damage.

Particulate matter 2.5 (PM 2.5); distribution; respiration

R563

ADOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850.2017.03.003

2017-03-21

2017-06-15

国家自然科学基金青年基金资助项目（81300047）

马叶冰，女（2000年），瑶族，武汉市第十一中学高中生，华中科技大学同济医学院2016年科技夏令营成员

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：2873465774@qq.com

#吕新，武汉市第十一中学生物学老师

Δ袁廷国，武汉市第十一中学物理学老师