核黄素磷酸钠的合成研究进展

刘 洁，徐诗琦，巨修练

武汉工程大学化工与制药学院，湖北 武汉430205

核黄素（riboflavin）也称维生素B2，化学名称为6，7-二甲基-10-（1'-D-核糖醇基）-异咯嗪，其结构式中核糖醇部分含有三个不对称碳原子，如图1所示，是维持生命所必需的一种水溶性维生素，是机体内许多酶系统的重要辅基—黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）与黄素单核苷酸（flavin mononucleotide，FMN）的构成成分，参与机体的能量与物质代谢［1］。鉴于核黄素具 有 广 泛 而 重 要 的 生 理 功 能［2］，WHO（Word Health Organization）将其列为评价人体生长发育和营养状况的六大指标之一。

核黄素的生理生化功能主要是由于核黄素分子中异咯嗪上1，5 位氮原子上存在的活泼共轭双键有关，既可做供氢体，又可做递氢体。在人体内以FAD 和FMN 两种形式参与体内的氧化还原反应，起到供氢、递氢的作用，是组成机体中非常重要的氧化还原酶的辅基，其主要参与的生化反应［3-5］有呼吸链的能量产生过程，氨基酸及脂类氧化，嘌呤碱转化为尿酸的代谢，芳香族化合物的羟基化代谢，蛋白质与某些激素的合成，铁的转运、储存及活化，参与叶酸、吡多醛、尼克酸等的代谢，对机体而言具有非常重要的作用。

由于在体内实际参与反应和起作用的是FMN，且与核黄素相比，黄素单核苷酸钠的水溶性远超过核黄素，故将核黄素磷酸化制成核黄素磷酸钠，不仅大大提高了核黄素在机体内的吸收，还增加了其生物利用度。核黄素磷酸钠［6］别名维生素B2 磷酸钠，核黄素-5'-（二氢磷酸酯）单钠盐，是核黄素的重要衍生物之一，其结构式如图1 所示，该产品为橙黄色结晶性粉末含2 个结晶水；无臭，味微苦；有吸湿性，在水中溶解度较大，在有机溶剂中几乎不溶。用于口角炎［7-9］、唇炎、舌炎［10-12］、眼结膜炎及阴囊炎［13-15］等疾病的治疗。与核黄素相比，核黄素磷酸钠在水中的溶解度远远高于核黄素，容易被机体吸收利用，且效价远高于核黄素，解决了核黄素只能口服不能制成注射剂的问题［16-18］。在临床上可被制成核黄素复合制剂、性质稳定的注射液［19-20］等，在使用上更加便利，应用范围广泛提高［21-23］。

图1 核黄素及核黄素磷酸钠结构式Fig. 1 Structures of riboflavin and riboflavin sodium phosphate

将一些水溶性较差的药物进行结构改造、引用亲水基团或成盐，使其水溶性提高是现有新药研发常用的一项技术方法。在不改变其药效作用的前提下，增加药物水溶性、提高药物在机体内的吸收利用，具有良好的市场前景。因此，将核黄素磷酸化制成核黄素磷酸钠，大大改善了核黄素水溶性差的问题，较大程度上解决了人们对于核黄素额外补给的需求，大幅度预防了由于核黄素缺乏而引起的一些疾病的发生，适应市场需求。核黄素磷酸钠主要有生物发酵发及化学合成法生产，但生物发酵发未见工业化的报道。本文主要介绍核黄素磷酸钠的化学法生产研究进展，在分析、总结文献的基础上，提出了黄素磷酸钠化学合成的展望。

1 生物发酵

2008 年日本专利报道了核黄素-5'-磷酸的制造方法［24］，在短波杆菌（Brevundimonas diminuta）存在条件下，以多聚磷酸、焦磷酸等含磷酸及其盐作为磷酸供体，加入一定量的核黄素，培养基，缓冲溶液，在适当的温度及pH 条件下发酵可以得到核黄素-5'-磷酸，含量可以达到98% 以上。核黄素-5'-磷酸在NaOH 作用下很容易得到核黄素-5'-磷酸钠。该方法得到的核黄素-5'-磷酸钠含量高，产品质量高，但分离纯化复杂，生产成本高，未见工业化大生产报道。

2 化学合成

最早报道核黄素磷酸钠的化学制备是20 世纪50 年代［25］，随后核黄素磷酸钠及其衍生物的合成也有报道［26-28］。目前，黄素磷酸钠的制备研究及工业化生产均采用化学合成法，主要合成工艺如图2。核黄素在缚酸剂如吡啶条件下与三氯氧磷反应或核黄素在耗酸剂如磷酸三甲酯、磷酸三乙酯、γ-丁内酯等条件下与三氯氧磷反应，水解得到核黄素-5'-磷酸酯，然后在NaOH 作用下中和得到目标产物核黄素-5'-磷酸钠，由于核黄素分子内2'、3'、4'、5'位均有羟基存在，只有5'磷酸化为有效体。因此如何提高核黄素5'位磷酸化是化学合成核黄5'磷酸钠的关键。

2.1 核黄素/三氯氧磷/吡啶/乙腈体系

孙文敬等［29］研究磷酸化反应中核黄素与POC13及H2O 的配比、反应温度、反应时间等因素对核黄素磷酸钠合成的影响。结果表明，在吡啶作为缚酸剂及乙腈作为溶剂的体系中，用4 倍摩尔的三氯氧磷比核黄素的量在35 ℃左右条件下反应2 h，然后水解反应混合物，再用NaOH 溶液中和调节pH，核黄素磷酸钠的收率可以达到75%以上。魏转等［30］在吡啶和乙腈的混合体系中，使用核黄素粗品与其4 倍摩尔量的三氯氧磷在35 ℃左右条件下反应2 h，然后水解反应混合物，再用NaOH 溶液中和调节pH 值，核黄素磷酸钠的收率可达68.5%以上，产品质量符合美国药典的各项要求。通过单因素试验，初步优化了核黄素粗品磷酸化反应的条件，即摩尔比：m（三氯氧磷）∶n（核黄素）= 4.6，m（三氯氧磷）∶n（水）= 1.65，反应时间2 h，反应温度（35±1）℃。研究结果表明，利用核黄素粗品制备核黄素5'-磷酸钠方法可行，具备工业化条件，特别是成本显著降低。在此方法的基础上，巨修练等专利报道［31］以核黄素/三氯氧磷/吡啶/水/乙腈体系进行了核黄素磷酸钠的制备研究，以核黄素、三氯氧磷、吡啶、纯化水为起始原料经过核黄素磷酸化反应生成核黄素环磷酸酯，核黄素环磷酸酯水解生成核黄素磷酸酯，核黄素磷酸酯与NaOH 成盐生成核黄素磷酸酯钠，该方法已工业化。利用该工艺生产的产品核黄素5'位的磷酸化有待于进一步提高。另外，张龙霞等［32-33］利用云计算技术研究了该体系的生产技术，提高了工艺参数的筛选效率。

2.2 核黄素/三氯氧磷/γ-丁内酯体系

2007 年，天津大学药学院代金玲［34］以三氯氧磷为起始原料，用γ-丁内酯作为耗酸剂代替缚酸剂吡啶，按n（核黄素）∶n（γ-丁内酯）∶n（三氯氧磷）=l∶4.5∶1.5 的摩尔投料比，在50 ℃下搅拌反应4 h，然后将上述反应液用质量分数20% 的NaOH 调至pH 9～9.5，搅拌30 min 后，过滤，降温到30 ℃以下用盐酸回调至pH 5～6，利用正交试验优化反应条件，制得核黄素磷酸钠，总收率为72.9%。与用吡啶为缚酸剂的工艺比较，利用γ-丁内酯作为耗酸剂收率提高了2.9%，操作简单，工艺可行，从成本核算来看，由于γ-丁内酯既为溶剂又为磷酸化反应产生的氯化氢消耗剂，反应产生的盐不容易回收，消耗大，价格又贵，其远远超出了用乙腈作溶剂的成本。但由于收率的提高，且γ-丁内酯的毒性远远低于乙腈和吡啶，降低了对环境的污染和对人体的不良影响。因此，该工艺路线相对吡啶为缚酸剂的工艺来讲更适用于工业生产，但5'位的磷酸化率较低，产品质量有待于进一步提高。

2.3 核黄素/三氯氧磷/磷酸三甲酯或磷酸三乙酯体系

参 考YOSHIKAWA 等［35］，Haile 等［36］及Lin等［37］合成糖苷的文献，进行了核黄素/三氯氧磷/磷酸三甲酯或磷酸三乙酯体系的研究［38］。将核黄素加入到10～15 倍的磷酸三甲酯中悬浮，然后将悬浮液冷却至0 ℃以下。剧烈搅拌下，向反应体系中缓慢滴加2 倍量的三氯氧磷，-5～0 ℃条件下反应4 h。然后用NaOH 溶液成盐，静置过滤得到核黄素磷酸钠成品。该方法相对于其它体系来讲，当反应溶剂换为磷酸三乙酯后，收率较高、副产物较少，产品纯度有明显提升，这对工业化生产更有利，更具实际利用价值，目前该工艺在进一步研究中。

3 展 望

核黄素以发酵发工业化生产，但核黄素磷酸钠工业生产以化学合成为手段，随着有机化学合成方法的不断发展，核黄素磷酸钠的合成方法也在不断发展中，如何提高产品质量，降低排放，降低成本是产品具有竞争力的主要指标，本文介绍的方法各有优缺点，由于核黄素分子内2'、3'、4'、5'位均有羟基存在，由于位阻作用，2'位磷酸化比较困难，从核黄素磷酸钠的HPLC 分析结果可以看出3'、4'、5'位均有不同程度的磷酸化，3'磷酸化在10% 以下，4'位在15% 以下，5'位在80% 左右，要提高产品质量，首先要考虑提高核黄素5'位磷酸化率，可以考虑在核黄素磷酸化以前保护核黄素分子内3'、4'位的两个羟基，这样磷酸化就只能在5'位磷酸化，然后水解脱保护就可能得到高质量的核黄素磷酸酯，将其与NaOH 成盐就可以生产出高质量的核黄素磷酸钠。黄素磷酸钠是核黄素的升级产品，水溶性好，生物活性更高，具有更广泛的用途，特别是对抗癌药物化疗引起的副作用具有较好的保护作用［39-40］，市场发展前景较好，对其合成工艺应不断改进，以适应市场的需求。