清湿外洗汤质量控制研究

薛敏菲，雷凯君，吴舜芳，黄建明

（广东省佛山市中医院，广东佛山528000）

清湿外洗汤质量控制研究

薛敏菲，雷凯君，吴舜芳，黄建明

（广东省佛山市中医院，广东佛山528000）

目的建立两煎常压煎药机所制清湿外洗汤的质量控制体系。方法采用薄层色谱法对清湿外洗汤中主要药味栀子、黄柏、蛇床子进行定性鉴别；采用高效液相色谱法对清湿外洗汤中主要活性成分苦参碱进行含量测定，色谱柱为XTerra Rp18柱(250mm×4.6mm，5 m)，流动相为乙腈－乙二胺－水(45∶0.05∶55)，流速为1.0mL／min，柱温35℃，检测波长220 nm；观察室温下避光保存的汤剂，在拟订的7 d储存期内苦参碱含量的变化，同时进行微生物限度检查。结果薄层色谱中均斑点清晰，无阴性干扰，分离度好，专属性强。苦参碱质量浓度在0.029 5～0.177 0 g／L线性范围内与峰面积呈良好的线性关系（r＝0.999 8）；平均回收率为97.41%（n＝6）。于室温下避光保存7 d苦参碱损失率为1.85%。结论该方法简单易行，灵敏度高，重复性好，专属性强，可用于清湿外洗汤的质量控制。两煎常压煎药机煎煮的清湿外洗汤于室温下避光保存7 d质量稳定。

清湿外洗汤；苦参碱；薄层色谱法；高效液相色谱法；质量控制

目前，中药行业从种植、药品的（非）临床试验研究、生产加工再到调配都有着各自一套完整的质量控制体系，唯有汤剂煎煮环节缺少相应完备的标准操作规程。随着现代化煎药中心的不断扩大，实现中药代煎规范化操作及质量管理，是当今中医药事业发展的当务之急。本研究中选取我院常用协定处方清湿外洗汤作为标准汤剂，其由苦参、栀子、黄柏、蛇床子等10多味中药组方，具有清毒、燥湿、止痒等功效，用于治疗湿热蕴结引致的湿疹湿疮、疥癣、阴肿阴痒等证。本研究中采用薄层色谱（TLC）法对栀子、黄柏、蛇床子进行定性鉴别，高效液相色谱（HPLC）法对方中君药苦参进行含量测定，为煎药中心标准汤剂的质量控制提供可靠的实验数据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

YFML20型两煎常压煎药机（北京东华原医疗设备有限责任公司）；Waters 1525型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；AE－200型电子天平（瑞士METTLER公司）；HHS11－4型恒温水浴锅（北京长安科学仪器厂）；101AS－4型不锈钢数显电热鼓风干燥箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）；ZF－90型暗箱式紫外透射仪（上海顾村电光仪器厂）；TC－15型套式恒温器（海宁市新华医疗器械厂）。

1.2 试药

苦参碱对照品（批号为110713－200208），栀子苷对照品（批号为110749－200512），盐酸小檗碱对照品（批号为110713－200208），蛇床子对照药材（批号为110822－200406），均由中国食品药品检定研究院提供；药材由广州致信药业有限公司提供，经佛山市中医院欧阳芳副主任中药师鉴定为正品；乙腈（高效液相色谱法中使用的均为色谱纯，国药集团化学试剂有限公司），水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 清湿外洗汤的制备

按清湿外洗汤处方组成调配3副，按照最佳制备工艺条件：第1次煎煮时间为30min，第2次煎煮时间为20min，浸泡时间为30min，煎煮加水量为1 200mL，通过两煎常压煎药机制成复方汤剂，每副汤剂量为300m L，分包装成每袋150m L，标明汤剂名称及试验批号(批号为1，2，3)，室温避光保存备用。

2.2 TLC鉴别

2.2.1 栀子[1－3]

取2.1项下备用汤剂20 m L，用正丁醇振摇萃取2次，每次25mL，合并正丁醇层，蒸干，残渣加无水乙醇1mL溶解，作为供试品溶液。同法取缺栀子阴性样品制成阴性对照品溶液。另取栀子药材1 g，加水30 mL，加热回流提取30min，放冷，滤过，取滤液20mL，按照供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。再精密称取栀子苷对照品，加无水乙醇制成每1m L含4.0mg的溶液，作为对照品溶液。照2015年版《中国药典(四部)》通则0502薄层色谱法试验，吸取上述4种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇－乙酸乙酯－水（2∶1∶1）的上层溶液为展开剂，展开缸内预先放入氨水平衡，预饱和30min，展开，展距约10 cm，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材及对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液色谱中无此斑点，见图1。

2.2.2 黄柏[4－6]

图1 薄层色谱图

取2.1项下备用汤剂15 m L，用乙醚提取2次，每次15mL，弃去乙醚层，合并水层，用氯仿提取2次，每次15 m L，合并氯仿层，蒸干，残渣加乙醇5 m L使溶解，乙醇液水浴浓缩至1 m L，作为供试品溶液。同法取缺黄柏阴性样品制成阴性对照品溶液。另取黄柏药材1 g，加水15m L，加热回流提取30min，放冷，滤过，取滤液15 m L，按照供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。再精密称取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1m L含500μg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，分别吸取上述供试品溶液5μL、对照药材溶液3μL、对照品溶液3μL和阴性对照溶液5μL，分别点于用一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯－甲苯－异丙烷－甲醇－浓氨（3∶6∶1.5∶1.5∶0.5）为展开剂，置氨蒸气饱和的层析缸内，展开，展距约13 cm，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液及对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液色谱中无此斑点。见图1。

2.2.3 蛇床子[7－9]

取2.1项下备用汤剂15 mL，加乙醚振摇提取2次，每次20mL。合并醚层，加饱和碳酸钠溶液5mL振摇。弃去水层，使醚液挥至2 mL，作为供试品溶液。同法取缺蛇床子阴性样品制成阴性对照品溶液。另取蛇床子对照药材3 g，加水40m L加热回流提取30 min，滤过，滤液加乙醚振摇提取2次，每次30mL。合并醚层，加饱和碳酸钠溶液7.5m L振摇。弃去水层，使醚液挥至2mL，作为对照药材溶液。照薄层色谱法试验，分别吸取上述供试品溶液5μL、对照药材溶液3μL和阴性对照溶液5μL，分别点于用一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯－正己烷（15∶85）为展开剂，展开，展距约13 cm，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液色谱中无此斑点。详见图1。

2.3 苦参碱含量测定

2.3.1 溶液制备

精密量取2.1项下备用汤剂10mL，置分液漏斗中，加入2mL氨水，摇匀，再加氯仿提取4次，每次30mL，合并氯仿层，蒸干，残渣加流动相使溶解，并转移至10mL容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，得供试品溶液。同法取缺苦参阴性样品制成阴性对照品溶液。精密称取苦参碱对照品适量，加流动相制成每1m L含59μg的对照品溶液。

2.3.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：XTerra Rp18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：乙腈－乙二胺－水(45∶0.05∶55)；流速：1.0 mL／min；柱温：35℃；检测波长：220 nm；进样量：10μL。理论板数以苦参碱峰计算应不低于2 000，见图2。

2.3.3 方法学考察

线性关系考察：称取苦参碱对照品适量，精密称定，加流动相制成每1m L含0.59 mg的对照品溶液。精密吸取上述溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL，分别置10m L容量瓶中，加流动相稀释并定容至刻度，摇匀，得标准系列溶液。分别进样10μL，按拟订色谱条件测定峰面积，记录色谱图，并以苦参碱质量浓度（X，g／L）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y＝1.80×106X－171.53，r＝0.999 8(n＝6)。结果表明，苦参碱质量浓度在0.029 5～0.177 g／L范围内与峰面积线性关系良好。

图2 苦参碱高效液相色谱图

精密度试验：精密吸取同一苦参碱对照品溶液10μL，重复进样6次，记录苦参碱峰面积。结果的RSD为0.40%（n＝6），表明仪器精密度较好。

重复性试验：取同一批号（批号为1）备用汤剂，平行制备6份供试品溶液，依法测定含量。结果苦参碱含量的RSD为1.05%（n＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一批号（批号为1）备用汤剂，依法制成供试品溶液。分别在室温下0，2，4，8，12 h时进样，测定苦参碱峰面积值。结果样品含量分别为0.039 9，0.039 6，0.039 4，0.038 9，0.037 7 g／L，RSD为2.21%（n＝5），表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

加样回收试验：精密吸取已知苦参碱含量(质量浓度为0.039 7 g／L)的供试品溶液4mL，共6份，分别加入0.059 g／L的苦参碱对照品溶液3 m L，加流动相定容至10m L，用0.45μm的微孔滤膜过滤。精密吸取上述溶液各10μL进样，依法测定含量。结果见表1。

表1 苦参碱加样回收测定结果（n＝6）

2.3.4 样品含量测定

分别取3个批号的药材，按2.1项下方法制成汤剂，室温下避光保存备用。分别于制备后的1，3，7，10，15 d，按2.3.1项下供试品溶液的制备方法制备成供试品溶液。精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μL，在拟订色谱条件下测定，每批平行测定2份，以外标法计算各样品中苦参碱的含量，并计算苦参碱的损失率。结果见表2。

表2 清湿外洗汤中苦参碱含量测定结果（n＝6）

2.4 微生物限度检查

随机抽取6批清湿外洗汤样品，每批5袋，分别于室温下避光保存的第1，3，7，10，15天检查1次，每次1袋，肉眼观察无变色、无结块等改变后，照2015年版《中国药典》通则1106微生物限度检查法进行细菌和霉菌总数检查，以及金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查。结果表明，常压煎药机所制清湿外洗汤室温下避光保存15 d，仍符合药品卫生标准。

3 讨论

3.1 定性鉴别

清湿外洗汤剂为复方汤剂，成分较复杂，对复杂的中药剂型，薄层分析是行之有效的鉴别方法。本研究中鉴别栀子、黄柏和蛇床子均用对照药材和（或）对照品同时作对照展开，通过多次试验，斑点清晰，结果明显，方法简便，稳定性及重现性好，具有专属性，可以对该方中的这3味药材进行有效鉴别，作为其是否存在的质量标准，达到本汤剂质量控制的目的。君药苦参，由于与方中其他成分极性相似，暂未得出最佳分离条件，本试验暂不列入定性鉴别项目，有待日后继续研究。

在栀子薄层色谱鉴别中，曾用药典方法丙酮－乙酸乙酯－甲酸－水（5∶5∶1∶1）作为展开系统[10]，但拖尾严重，分离效果不好，故改为文献方法，效果较佳。在黄柏薄层色谱鉴别中，氨蒸气的饱和程度是图谱成败的关键，其以蒸气相的形式参与黄柏生物碱的分离，浓度不足明显降低生物碱斑点的Rf值，甚至停留在原点，故浓氨溶液预饱和时间必须控制在30～45min[11]。

3.2 含量测定

供试品溶液苦参碱色谱峰的保留时间与对照品溶液色谱峰的保留时间一致，阴性对照品溶液在相同的保留时间处无色谱峰；且供试品溶液苦参碱色谱峰与其他组分峰分离完全，表明其他组分药材对样品中苦参碱的测定无干扰。通过HPLC进行含量测定，观察含量变化，计算损失率，可知于制备第7天苦参碱含量下降为1.85%，由此判断7 d内室温避光保存，清湿外洗汤含量相对稳定。

综上所述，定性鉴别和含量测定方法的建立，加上微生物限度检查，可有效控制两煎常压煎药机所制清湿外洗汤的质量，为中医药临床应用提供了科学、可靠的理论基础和实验数据。

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Quality Control of Q ingshiwaixi Decoction

Xue Minfei,Lei Kaijun,Wu Shunfang,Huang Jianming
(Foshan Hospital of TCM,Foshan,Guangdong,China 528000)

Objective To establish a quality control system of Qingshiwaixi Decoction extracted by two fried normal pressure decocting machine.M ethods The main ingredients of Fructus Gardeniae,Cortex Phellodendri,Fructus Cnidii in Qingshiwaixi Decoction were identified by TLC,the content of main active ingredient matrine in Qingshiwaixi Decoction was determined by HPLC with XTerra Rp18column(250 mm×4.6 mm,5μm),acetonitrile－ethylenediamine－water(45∶0.05∶55)was used as mobile phase,the flow rate was 1.0 mL／min,the column temperature was set at 35℃,the wavelength of the detector was set at 220 nm.The content change of matrine was observed within 7 days at room temperature and avoided light,meanwhile,microbial limit test was carried out.Resu lts The TLC method had no negative interference,good separation and highly specificity with all the spots were clear.The linear range for matrine was 0.029 5－0.177 g／L(r＝0.999 8).The average recovery were 97.41%(n＝6).The content of matrine in Qingshiwaixi Decoction showed 1.85%decrease in the 7th day.Conclusion The method is simple,highly sensitive,highly repeatable and specific,it can be used for quality control of Qingshiwaixi Decoction.Qingshiwaixi Decoction can be kept stably at room temperature and avoided light lasting 7 days after it was extracted by two fried normal pressure decocting machine.

Qingshiwaixi Decoction;matrine;TLC;HPLC;quality control

R283.6；R284.1

A

1006－4931(2017)11－0009－04

2017－03－15)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.11.003

广东省佛山市医学类科技攻关项目[2016AB002051]。

薛敏菲，女，硕士研究生，主管中药师，研究方向为中药及其制剂质量标准研究，（电话）0757－83063171（电子信箱）68374812＠qq.com。