高效液相色谱法同时测定健脾益肾方水提物中松果菊苷、丹酚酸B和大黄酸含量

何泰东，余晓丹，郑平，邹美南，张尚斌，陈剑平，李顺民

（广东省深圳市中医院深圳市医院中药制剂研究重点实验室，广东深圳518033）

高效液相色谱法同时测定健脾益肾方水提物中松果菊苷、丹酚酸B和大黄酸含量

何泰东，余晓丹，郑平，邹美南，张尚斌，陈剑平，李顺民

（广东省深圳市中医院深圳市医院中药制剂研究重点实验室，广东深圳518033）

目的建立同时测定健脾益肾方水提物中松果菊苷、丹酚酸B和大黄酸含量的高效液相色谱法。方法色谱柱采用InertsilODS－SP柱（150mm×4.6mm，5 m），以乙腈－0.2%磷酸溶液为流动相梯度洗脱，流速为1.0mL／min，检测波长330 nm（松果菊苷）、286 nm（丹酚酸B）、254 nm（大黄酸），进样量10 L。结果松果菊苷、丹酚酸B、大黄酸检测质量浓度的线性范围为2.50～80.0 g／m L（r＝0.999 4），1.25～80.00 g／m L（r＝0.999 3），1.25～40.00 g／m L（r＝0.999 4）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD小于2%（n＝6）；平均回收率分别为100.01%，99.15%，98.95%，RSD均小于2%（n＝6）。结论该方法，操作简单、重复性好、专属性强，方法可靠，可作为健脾益肾方水提物中松果菊苷、丹酚酸B、大黄酸的含量测定方法。

健脾益肾方；高效液相色谱法；含量；松果菊苷；丹酚酸B；大黄酸

健脾益肾方是基于国医大师邓铁涛教授“五脏相关学说”理论，并结合我院治疗慢性肾衰竭20余年的临床经验总结而成的有效方剂[1－2]。该方由黄芪、酒苁蓉、丹参、大黄等8味药组成，具有健脾益肾、活血化浊之功，主治慢性肾功能衰竭脾肾阳气虚，兼有湿浊、水气和瘀毒等证。方中酒苁蓉温肾扶阳、润肠通便，丹参活血祛瘀，大黄消散结、荡涤肠胃、推陈致新，均为该方的主要药物，目前尚无其测定方法。其中酒苁蓉的指标成分为松果菊苷，丹参的指标成分为丹酚酸B，大黄的指标成分为大黄酸[3－6]，本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法，在同一条件下对以上3个成分同时进行测定，并进行了系统的方法学考察，以确保该方提取物在临床和动物研究中有可行的质量控制方法，也可为之后的制剂质量控制研究提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

LC－20AT型高效液相色谱仪，包括柱温箱、自动进样器、二极管阵列检测器、LC solution色谱工作站（日本岛津公司）；Sartorius BP 211D型电子天平（十万分之一，德国Sartorius公司）；CQ－250－DST型超声波清洗机（上海跃进医用光学器械厂）；TGL－21M型高速冷冻离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）；FD－1C－80型冷冻干燥仪（上海比朗仪器有限公司）。

黄芪，白术，山药，酒苁蓉，豆蔻，丹参，大黄，炙甘草均购自深圳华辉药业有限公司，批号分别为150621，141230，150615，150620，150617，150626，150104，150615，经深圳市中医院张尚斌主任中药师鉴定为正品；松果菊苷对照品(批号为111670－201304，纯度大于98%)，丹酚酸B对照品（批号为110821－201313，纯度大于98%），大黄酸对照品（批号为110757－200206，纯度大于98%）均购于中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯（默克公司），水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 健脾益肾水提物的制备

按处方比例称取黄芪、酒苁蓉、丹参、大黄等8味药材，置提取器中，第1次加10倍量水，第2次加8倍量水，煎煮2次，每次1 h。煎液滤过，滤液合并，离心后，用冷冻干燥机干燥，冻干粉置－20℃以下冰箱保存，备用。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Inertsil ODS－SP柱(150 mm×4.6 mm，5μm)；流动相：0.2%磷酸溶液(A)，乙腈(B)，梯度洗脱(0～5min，90%A；5～10min，90%～80%A；10～30min，80%～50%A；30～40min，90%A)；流速：1.0m L／min；检测波长：330 nm(松果菊苷)，286 nm(丹酚酸B)，254 nm (大黄酸)；进样量：10μL。在上述色谱条件下，理论板数按松果菊苷峰计算应不低于5 000，分离度大于1.5。

2.3 溶液制备

分别取松果菊苷、丹酚酸B和大黄酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1m L含80μg的混匀溶液，即得对照品溶液。取本品粉末0.2 g，精密称定，放入50m L离心管内，加入超纯水20 mL，超声30 min，放置室温，混匀后离心，移取上清液，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按健脾益肾方提取制备工艺制得缺酒苁蓉、丹参及大黄阴性样品，按供试品溶液的制备方法制得阴性对照品溶液。

2.4 方法学考察

专属性试验：取2.3项下3种溶液各10μL，在拟订色谱条件下进样。结果供试品溶液色谱在与对照品溶液色谱相同的保留时间处有相同色谱峰，阴性对照品溶液则无此峰，表明无干扰（图1）。

线性关系考察：精密吸取松果菊苷、丹酚酸B、大黄酸对照品贮备液，质量浓度均为80μg／mL，加甲醇稀释，分别制得质量浓度在1.25～80μg／m L的系列母液，按上述色谱条件测得峰面积，并以峰面积（Y）与质量浓度（X，μg／mL）绘制标准曲线并进行线性回归。松果菊苷、丹酚酸B及大黄酸的回归方程分别为Y＝13 084X＋16 222，r＝0.999 4；Y＝12 474X＋17 334， r＝0.999 3；Y＝33 371X＋10 863，r＝0.999 4。结果表明，松果菊苷、丹酚酸B、大黄酸质量浓度线性范围分别为2.5～80.00，1.25～80.00，1.25～40.00μg／mL。

图1 高效液相色谱图

精密度试验：精密量取同一对照品溶液，按拟订色谱条件重复进样6次。结果松果菊苷、丹酚酸B、大黄酸的RSD分别为1.1%，1.0%，0.7%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，24 h时进样，每次10μL。结果松果菊苷、丹酚酸B、大黄酸峰面积的RSD分别为1.1%，1.8%，0.6%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取同批样品6份，依平行制备6份供试品溶液进行测定。结果松果菊苷、丹酚酸B、大黄酸含量的RSD分别为1.5%，0.5%，1.0%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品约0.1 g，精密称定，共6份，分别加入混合对照品溶液（松果菊苷180μg，丹酚酸B 800μg，大黄酸30μg），按2.3项下操作方法制备溶液，进样测定，计算回收率。结果见表1。

2.5 样品含量测定

按拟订方法对3批样品进行测定，结果见表2。

3 讨论

3.1 方法确定

中药品质可能受气候、地域、土壤和采收季节等因素影响。健脾益肾方为中药复方，其质量也会受到以上因素的影响[7]。因此，制订该方提取物的质量控制方法，一方面，可确保标准化提取物的制备，为之后制剂质量控制提供参考依据；另一方面可保证该方提取物在临床研究和生物活性评价中的可重复性。HPLC是检测物质含量测定的常用手段之一，以HPLC具有的色谱峰的特征性，作为药物指标性成分的含量测定和药物鉴别的依据，是各国药典共同采用的检测方法，能客观揭示和反映中药内在质量的整体性和特征性，用以评价中药的真实性、有效性、稳定性和一致性。因此，本研究中采用HPLC法测定健脾益肾方提取物中的指标性成分，建立该方提取的质量控制手段。

表1 加样回收试验结果（n＝6）

表2 样品含量测定结果（n＝3)

3.2 色谱条件选择

松果菊苷、丹酚酸B和大黄酸的HPLC测定方法2015版《中国药典》有收载，本研究中在以上条件的基础上进行预试验，以建立能同时满足对3种成分进行有效分离的测定方法。比较发现，以0.2%磷酸溶液－乙腈为流动相进行梯度洗脱优于0.2%甲酸和乙腈。

3.2 波长选择

同时根据中国药典[8]，选取3个成分各自的最大吸收波长作为检测波长。对于色谱柱的选择，本研究发现，长的色谱柱和短的色谱柱都能达到很好的分离，为缩短分析时间，因此选择短的色谱柱。参照以上条件进行分析，样品色谱图呈现整体较好的色谱峰，各特征峰峰形好、保留时间适中，与其他组分能达到基线分离，且分离度好。此外，也尝试对黄芪中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷进行测定[9－10]，但该成分与肉苁蓉中含有的毛蕊花糖苷相互干扰大，因此未对其进行含量测定，这是本研究的不足之处。后续研究将考虑采用液相色谱－质谱联用(LC－MS)法对二者成分进行同时测定。

综上所述，本研究中建立的含量测定方法，快速、简便，采用一次提取，同时测定，减少了操作步骤，节约了时间和成本，从而提高了分析效率。该方法可作为健脾益肾方提取物内在化学指标成分含量测定的质控方法。

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Sim u ltaneously Content Determ ination of Echinacoside,Salvianolic Acid B and Rheic Acid in Jianpi Yishen Form ula by HPLC

He Taidong,Yu Xiaodan,Zheng Ping,Zou Meinan,Zhang Shangbin,Chen Jianping,Li Shunmin

(Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Preparation Research in Shenzhen Hospital,Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital,Shenzhen,Guangdong,China 518033)

Objective To establish an HPLC method for the content determination of echinacoside,salvianolic acid B and rheic acid in Jianpi Yishen Formual simultaneously.M ethods The Inertsil ODS－SP column(150 mm×4.6 mm,5μm)was adopted with acetonitrile－0.2%phosphoric acid as mobile phase using gradient program,the flowing rate was 1.0 mL／min,the detection wavelength was 330 nm(echinacea),286 nm(salvianolic acid B),and 254 nm(rhein acid),the sample size was 10μL.Results The calibration curves of echinacoside,salvianolic acid B and rheic acid were linear from 2.50－80.00μg／mL(r＝0.999 4),1.25－80.00μg／mL(r＝0.999 3),1.25－40.00(r＝0.999 4)μg／mL,the accuracy,stability,and reproducibility of the RSD were less than 2.00%(n＝6),the average recovery was 100.01%,99.15%,98.95%,respectively,the RSD was less than 2.00%(n＝6).Conclusion The method is simple,efficient,accurate and reproducible,which can be used for the content determination of echinacoside,salvianolic acid B and rheic acid in Jianpi Yishen Formula.

Jianpi Yishen Formula;HPLC;content;echinacoside;salvianolic acid B;rheic acid

R284.1

A

1006－4931(2017)11－0025－03

2016－10－01；

2017－02－03)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.11.008

广东省自然科学基金项目[2015A 030310247]；广东省中医药局项目[20162124]；广东省深圳市科技计划项目[JSGG20141017103353178，JCYJ20150401163247213，ZDSYS20160608151545865]。

何泰东，大学本科，副主任药师，研究方向为中药研究，（电子信箱）lycjp＠126.com。

李顺民，博士研究生，教授，研究方向为中医肾病研究，（电子信箱）zyylishunmin＠126.com。