曲古霉素A预处理的hUC-MSCs移植对小鼠脑损伤的神经修复作用*

程 康，马珊珊#，程 田，邢 衢，黄团结，石振庆，张 涛，刘雯雯，许 玲，关方霞#

1)郑州大学生命科学学院干细胞研究室 郑州 450001 2)郑州大学第一附属医院骨科 郑州 450052

曲古霉素A预处理的hUC-MSCs移植对小鼠脑损伤的神经修复作用*

程 康1)，马珊珊1)#，程 田2)，邢 衢1)，黄团结1)，石振庆1)，张 涛1)，刘雯雯1)，许 玲1)，关方霞1)#

1)郑州大学生命科学学院干细胞研究室 郑州 450001 2)郑州大学第一附属医院骨科 郑州 450052

#通信作者：关方霞，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：干细胞与再生医学，E-mail：guangfangxia@126.com；马珊珊，女，1984年5月生，博士，副教授，研究方向：干细胞与神经功能修复，E-mail：mashanshan84@163.com

曲古霉素A；人脐带间充质干细胞；移植；脑损伤；神经修复

目的：探讨30 nmol/L曲古霉素A(TSA)预处理的人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)移植对脑损伤(TBI)小鼠的神经修复和促进作用。方法：利用颅脑打击器和立体定位仪制作中度脑损伤小鼠模型，并将造模成功的27只小鼠随机分为Veh组、MSCs组和TSA+ MSCs组；术后3天，PI染色评估各组小鼠脑损伤周围的细胞坏死情况，术后第1、2、3、7、14、21和28天，采用神经功能缺损程度评分(NDS评分)和糖水偏好实验评估小鼠神经运动感觉和抑郁情况；术后第28天采用qRT-PCR检测组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)和神经元特异性相关基因(DCX、MAP2)的表达。结果：与Veh组相比，MSCs组和TSA+MSCs组小鼠脑损伤周围的坏死细胞数明显减少，其中TSA+MSCs组降低更为明显(P<0.001)。术后第1天，各组小鼠的NDS评分差异无统计学意义；从术后第3天开始，TSA+MSCs组小鼠NDS评分低于MSCs组和Veh组(P<0.001)；术后第28天，与其他两组相比，TSA+MSCs组小鼠蔗糖偏嗜度增强、HDAC1表达量降低，MAP2、DCX的表达量增加(P<0.001)。结论：TSA预处理能够有效促进hUC-MSCs移植对TBI小鼠的神经修复。

创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)是由外力作用于头部造成的严重创伤[1]。目前在临床上对TBI带来的神经功能的破坏缺乏有效的治疗手段。课题组前期研究[2-3]表明，人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)移植和能产生MSCs的沃顿胶虽然对TBI有一定的治疗效果，但干细胞定向分化效率低,致使干细胞移植对TBI的治疗不足。乙酰化修饰是研究较为广泛的一类表观遗传学干预手段，乙酰化水平主要由组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)和乙酰化酶(histone acetyltransferase，HAT)共同调控[4]。 组蛋白的乙酰化水平影响突触活性和神经元的功能，多种神经相关疾病的发生都伴随HDAC水平的下降。 而使用 HDAC 抑制剂(HDACi)能够上调HDAC的水平,明显缓解疾病的症状。研究[5]发现HDACi在脊髓损伤模型中可以介导神经保护和神经再生。曲古霉素A(trichostatin A，TSA)是HDAC的抑制剂，研究[6]发现TSA下调HDAC的表达后，神经元分化效率增加,并且在脑损伤后病灶区的乙酰化水平显著降低[7]。但是，TSA预处理的hUC-MSCs移植对TBI小鼠的神经修复作用尚未见报道，为此，作者进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和材料 hUC-MSCs为课题组前期冻存，DMEM/F12培养基购自宝信生物科技有限公司，胎牛血清购自美国Gemini公司，TSA、PI购自美国Sigma公司，RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司，NeuN抗体购自CST公司，荧光二抗CY3购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 实验动物 实验采用清洁级的雄性C57BL/6野生型小鼠，体重20～22g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，在22 ℃恒温、相对湿度为60%的条件下进行饲养。

1.3 TBI模型建立和侧脑室移植 用体积分数10%的水合氯醛对小鼠进行麻醉，采用自由落体脑皮质损伤模型，在小鼠颅脑右侧前囟后1.5 mm、中线旁侧1.5 mm处，将直径3 mm的环形钻开一个骨窗，确保脑膜完好，利用立体定位仪，将直径2.5 mm的20 g撞针正对骨窗，从20 cm高度处释放撞针，撞击后迅速提起撞针，使用牙科钻在小鼠颅脑左侧前囟后0.5 mm、旁开0.9 mm处开一个直径为1.0 mm的小孔，深3.1 mm，将处理液通过立体定位仪进行侧脑室注射，损伤部位用骨蜡覆盖，缝合。

1.4 hUC-MSCs的预处理及实验动物分组 TSA 预处理hUC-MSCs：选取长势良好的P3代hUC-MSCs ，待细胞密度达到50%，在含有体积分数10%FBS的DMEM/F12培养基中加入终浓度为30 nmol/L的TSA，培养48 h后，倒掉培养基，并用PBS清洗3次，胰酶消化收集细胞。采用随机数字表法将27只造模成功的C57BL/6野生型小鼠分为生理盐水组(Veh组)，hUC-MSCs移植组(MSCs组)、TSA预处理MSCs组(TSA+MSCs组)，每组9只，分别向3组小鼠侧脑室注射等剂量的生理盐水、5×104个MSCs和TSA预处理的5×104个hUC-MSCs。

1.5 各组小鼠大脑损伤部位细胞坏死情况检测 采用PI染色。各组取3只处理后3 d的小鼠，将PI用生理盐水稀释，以0.4 mg/kg剂量腹腔注射。注射后1 h处死，灌注，取脑，冰冻切片，片厚20 μm，用DAPI染细胞核，荧光显微镜下观察结果。200倍视野下，每只小鼠于脑损伤部位选取3个视野，统计PI阳性细胞数。

1.6 各组小鼠神经功能缺损程度(NDS)评分 分别在脑外伤后第1、3、7、14、21和28天检测小鼠的神经功能缺损状况[8]。

1.7 糖水偏好实验 脑外伤21 d后，配制10 g/L蔗糖水，装入小鼠喂水器中。每组取3只小鼠，每个笼子里放1只小鼠、两个喂水器，小鼠适应糖水味道3 d后，将其中一个喂水器中的糖水用纯水代替，分别进行称重记录；脑外伤28 d后，再次称重记录，两次的差值即为小鼠糖水消耗量和纯水消耗量，计算小鼠蔗糖偏嗜度。蔗糖偏嗜度=糖水消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)×100%。

1.8 各组小鼠脑组织中HDAC1和神经元特异性相关基因mRNA的表达 脑损伤后28 d，每组小鼠各取3只，使用体积分数10%水合氯醛麻醉后处死，取出脑组织，收集脑损伤侧周围的组织，根据文献[9]描述进行RNA提取和实时荧光定量PCR检测。引物序列和大小见表1。实验结束后，根据融解曲线和扩增曲线，采用比较CT法进行数据分析。

表1 PCR引物序列

1.9 统计学处理 采用SPSS 19.0进行分析，应用单因素方差分析比较各组小鼠脑损伤部位PI阳性细胞数目、小鼠蔗糖偏嗜度、脑组织中HDACI和神经元特异性相关基因表达的差异，应用重复测量数据的方差比较各组小鼠NDS评分的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组小鼠脑损伤部位细胞坏死检测结果 PI染色结果见图1。TSA+MSCs组坏死细胞数目(104.00±5.72)少于MSCs组(139.00±7.48)和Veh组(171.67±10.66)，差异有统计学意义(F=33.977，P<0.001)；MSCs组坏死细胞数目少于Veh组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 各组小鼠NDS评分的比较 见表2。

A：Veh组；B：MSC移植组；C：TSA+MSC移植组。图1 各组小鼠脑损伤部位细胞坏死情况(PI,×200)

表2 术后各组小鼠NDS评分比较

F组间=227.334，P<0.001；F组内=133.629，P<0.001；F交互=5.828,P<0.001。*：与Veh组相比，P<0.05；#：与MSCs相比，P<0.05。

2.3 各组小鼠糖水偏好实验结果 TSA+ MSCs组蔗糖偏嗜度[(61.30±5.08)%]明显高于Veh组[(49.81±1.46)%]和MSCs组[(51.50±2.45)%](F=16.955，P<0.001)。

2.4 各组小鼠HDAC1和神经元特异性相关基因mRNA的表达 见表3。结果显示，与Veh组相比，MSCs组和TSA+ MSCs组的HDAC1的表达量降低，其中TSA+MSCs组中降低更显著。TSA+MSCs组MAP2和DCX mRNA相对表达量高于Veh组和MSCs组。

表3 各组小鼠HDAC1和神经元特异性相关基因mRNA的表达

*:与Veh组相比，P<0.05；#：与MSCs组相比，P<0.05。

3 讨论

在工业和交通运输业发展的今天，脑外伤已成为一种伤残率极高的常见中枢神经类损伤性疾病[10]。脑损伤常常会伴随神经功能的障碍，为了系统评价干细胞移植对TBI的改善作用，作者采用NDS评分评价各组小鼠的运动感觉功能，用糖水偏好实验测定小鼠的忧郁情况。结果显示，术后第1天3组的得分差异无统计学意义，TSA+MSCs组从术后第3天开始，得分小于其他2组，与Veh组相比，MSCs组从术后第7天开始，得分明显降低。这与之前MSCs移植对TBI有一定的疗效的研究一致[11]。蔗糖偏好实验结果表明，与MSCs组和Veh组相比，TSA+ MSCs组可以显著增加蔗糖偏嗜度，而MSCs组和Veh组未见明显差异。上述结果说明TSA+ MSCs组较于MSCs单独移植，能够更好地改善TBI小鼠的运动能力，降低小鼠抑郁程度。

脑外伤神经功能缺失主要与神经细胞的凋亡有关，PI可以透过受损的细胞膜对细胞核染色，但是不能穿过活细胞膜。因此作者在术后第3天，通过PI染色显示大脑损伤周围的细胞凋亡情况。结果显示，TSA+MSCs组和MSCs组细胞坏死数明显少于Veh组，而且TSA+MSCs组细胞坏死数目更少。说明TSA+MSCs组可以减少大脑损伤周围神经细胞的坏死。

HDAC1是HDAC家族的关键成员，qRT-PCR结果显示，相较于其他组，TSA+MSCs组损伤部位HDAC1的表达量最少。该结果说明TSA预处理可以有效抑制HDAC的表达，进而调控损伤部位乙酰化水平，在神经修复中发挥作用。

脑损伤后神经功能恢复的关键是神经细胞的再生。多能干细胞要先分化为神经干细胞，继续分化为神经前体细胞，继而分化为成熟的神经细胞[12]。作者的研究结果显示，术后第28天，TSA+MSCs组中神经元前体细胞和成熟神经元的特异性标记基因DCX和MAP2的表达量明显高于另外两组。该结果说明，TSA+MSCs组可以更好地促进损伤部位神经细胞的再生。

综上所述，TSA预处理通过降低损伤部位HDAC1的表达，增加乙酰化程度，减少神经细胞坏死，促进神经再生，可显著提高hUC-MSCs移植对脑损伤的神经修复效果。

[1]BOND AM,MING GL,SONG H.Adult mammalian neural stem cells and neurogenesis:five decades later[J].Cell Stem Cell,2015,17(4):385

[2]CHENG T,YANG B,LI D,et al.Wharton’s Jelly transplantation improves neurologic function in a rat model of traumatic brain injury[J].Cell Mol Neurobiol,2015,35(5):641

[3]张文进.人脐带沃顿胶间充质干细胞移植治疗对大鼠脑损伤区微循环的影响[D].郑州:郑州大学,2014.

[4]吕建祎.SirT7在RA诱导P19细胞神经分化过程中的功能研究[D].北京:中国协和医科大学,2010.

[5]CHU T,ZHOU H,LU L,et al.Valproic acid-mediated neuroprotection and neurogenesis after spinal cord injury: from mechanism to clinical potential[J].Regen Med,2015,10(2):193

[6]LIU HL,WU H,WANG YX,et al.Inhibition of class Ⅱ histone deacetylase blocks proliferation and promotes neuronal differentiation of the embryonic rat neural progenitor cells[J].Acta Neurobiol Exp (Wars),2012,72(4):365

[7]YANG XJ, SETO E. HATs and HDACS: from structure,function and regulation to novel strategies for therapy and prevention[J].Oncogene,2007,26(37):5310

[8]GLUSHAKOV AV,ROBBINS SW,BRACY CL,et al.Prostaglandin F2α FP receptor antagonist improves outcomes after experimental traumatic brain injury[J].J Neuroinflammation,2013,10:132

[9]孟楠,马珊珊,王欣欣,等.氯化锂联合hUC-MSCs移植对阿尔茨海默鼠的治疗作用[J].郑州大学学报(医学版),2016,51(2):157

[10]励建安.脑外伤康复的现状与未来发展趋势[J].中国康复医学杂志,2011,26(12):1095

[11]GUAN J,ZHU Z,ZHAO RC,et al.Transplantation of human mesenchymal stem cells loaded on collagen scaffolds for the treatment of traumatic brain injury in rats[J].Biomaterials,2013,34(24):5937

[12]武菲,张秋玲.神经干细胞增殖分化研究中的常用标记物[J].中华行为医学和脑科学杂志,2013,22(3):283

(2016-09-19收稿 责任编辑赵秋民)

hUC-MSCs transplantation improves nerve repairment with TSA pretreatment in a mice model of traumatic brain injury

CHENGKang1),MAShanshan1),CHENGTian2),XINGQu1),HUANGTuanjie1),SHIZhenqing1),ZHANGTao1),LIUWenwen1),XULing1),GUANFangxia1)

1)StemCellLaboratory,SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)DepartmentofOrthopedics,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

trichostatin A;hUC-MSCs;transplantation;traumatic brain injury;nerve repairmen

Aim: To investigate the neuroprotective effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) transplantation with 30 nmol/L trichostatin A(TSA) pretreatment in a mice model of traumatic brain injury(TBI) .Methods: TBI models were produced by using the head hit, and the 27 mice were randomly allocated into vehicle group, MSCs transplantation group and TSA combined with MSCs transplantation group. After 3 days, PI staining was used to analyze the neuron cell necrosis around the injured site. NDS system and Sucrose preference test were used to evaluate sensory function of mouse nerve and the depression of mice on the 1st,2nd,3rd,7th,14th,21st,and 28th day. The relative expression levels of HDAC1, DCX and MAP2 were detected by qRT-PCR.Results: On the 3rd day after operation, compared with Veh group, the number of necrosis cells in MSCs transplantation group and TSA+MSCs transplantation group were significantly reduced, especially the latter group(P<0.001).There was no significant difference in NDS score among the 3 groups in the 1st day. On 3rd day after operation, the NDS score of TSA+MSCs transplantation group was significantly lower than those of MSCs transplantation group and Veh group(P<0.001). On the 28th day after operation, compared with the other 2 groups, the degree of sucrose preference in the 28 day after surgery was increased, HDAC1 expression was reduced, and the expressions of DCX and MAP2 in TSA+MSCs transplantation were enhanced(P<0.001).Conclusion: TSA pretreatment could effectively improve the nerve repairment of hUC-MSCs transplantation in TBI mice.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.003

*国家自然科学基金资助项目 U1404313，81471306和81601078；河南省高校科技创新团队 15IRTSTHN022；河南省科技创新人才计划 154200510008；河南省国际人才合作项目 2016GH03，2016GH15

R742