远志提取物对阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力的干预效果*

彭 芳，崔渊博，宋文颖，张家薇，刘俊保，关方霞

1)郑州澍青医学高等专科学校临床医学系 郑州 450064 2)郑州大学附属郑州中心医院转化医学中心 郑州 450007 3)郑州大学人民医院中医科 郑州 450003 4)郑州大学生命科学学院 郑州 450001

远志提取物对阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力的干预效果*

彭 芳1)，崔渊博2)，宋文颖1)，张家薇1)，刘俊保3)#，关方霞4)#

1)郑州澍青医学高等专科学校临床医学系 郑州 450064 2)郑州大学附属郑州中心医院转化医学中心 郑州 450007 3)郑州大学人民医院中医科 郑州 450003 4)郑州大学生命科学学院 郑州 450001

#通信作者:刘俊保，男，1966年3月生，博士，主任医师，研究方向:中西医结合，E-mail:Liu-371@sohu.com; 关方霞，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向:干细胞与再生医学、神经认知及调控，E-mail:guanfangxia@126.com

远志提取物；阿尔茨海默病；学习记忆能力；小鼠

目的：探讨远志提取物对阿尔茨海默病(AD)小鼠学习记忆能力的影响。方法：将28只6月龄雄性AD模型小鼠随机均分为4组，对照组和A、B、C组。A、B和C组小鼠连续3个月分别口服远志提取物50、100、200 mg/(kg·d)，对照组小鼠口服等量溶剂。3个月后，采用Morris水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力，采用ELISA法测定小鼠海马组织中可溶性与不溶性Aβ40、Aβ42含量及β分泌酶1(BACE1)、γ分泌酶活性，分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测小鼠海马组织中脑啡肽酶(NEP)、胰岛素降解酶(IDE)、MMP-9 mRNA及蛋白的表达水平，采用Western blot法检测小鼠海马组织中脑源性神经营养因子(BDNF)、BDNF酪氨酸激酶受体B(TrkB)及磷酸化TrkB(p-TrkB)、环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)及磷酸化CREB(p-CREB)的表达水平。结果：与对照组相比，C组小鼠穿越平台次数增加、逃避潜伏期缩短(P<0.05)；A、B、C组小鼠海马组织中可溶性与不溶性Aβ40、Aβ42含量降低，NEP、IDE mRNA及蛋白表达水平升高，BDNF、p-TrkB及p-CREB蛋白表达水平升高(P均<0.05)，且C组小鼠上述指标的变化更明显(P<0.05)。而3组小鼠海马组织中BACE1和γ分泌酶活性、MMP-9表达及TrkB、CREB蛋白表达水平无变化(P>0.05)。结论：远志提取物可有效改善AD小鼠的学习记忆能力，促进Aβ降解与调节BDNF/TrkB信号通路可能是其分子作用机制。

Effect of radix polygalae on learning and memory ability of Alzheimer′s disease mice

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种年龄相关的中枢神经系统退行性变化的疾病，以进行性学习记忆能力减退、语言功能障碍及人格改变等为主要临床表现。脑部病理特征主要包括β淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)沉积形成的老年斑、Tau蛋白过度磷酸化形成的神经元纤维缠结、神经元丢失、炎症反应等[1]。 AD的发病机制复杂，可能涉及多条信号调节途径，迄今仍无特效疗法。采用具有毒副作用小、效果良好、多靶点作用的传统中药进行AD干预治疗的研究越来越广泛，可能成为有效治疗AD的临床策略[2]。远志提取物源自益智健脑中药远志，含有皂苷、寡糖脂类等多种活性成分，具有提高记忆、抗炎、抗衰老等神经保护作用。目前研究[3-5]发现，远志提取物可明显提高AD模型小鼠的学习记忆能力并改善脑部Aβ沉积，但其作用机制仍不明确。该研究采用远志提取物干预AD模型小鼠，从行为功能学、生化与分子生物学水平观察干预效果并探讨可能的分子作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 远志购自山西亳州百川药业有限公司。远志提取物由远志经体积分数75%乙醇浸泡、超声破碎、残渣过滤、茄型瓶旋蒸得到的膏状提取物。经聚乙二醇加蒸馏水溶解获得[6-7]。Aβ40、Aβ42、β分泌酶1(BACE1)与γ-分泌酶ELISA检测试剂盒，匀浆器，T-PER试剂等均购自Thermo Fisher公司；Trizol，cDNA反转录试剂盒，荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司；β-actin、脑啡肽酶(neprilysin, NEP)、胰岛素降解酶(insulin-degrading enzyme, IDE)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)、脑源性神经营养因子(BDNF)、BDNF酪氨酸激酶受体B(TrkB)及磷酸化TrkB(p-TrkB)、环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)及磷酸化CREB(p-CREB)兔抗鼠一抗，羊抗兔二抗，PVDF膜，脱脂奶粉，发光试剂盒等均购自Sigma公司。

1.2 动物来源及实验分组 清洁级C57BL/6 淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)转基因小鼠购自中国协和医科大学动物所，合笼繁殖，饲养于全自动独立送风笼具，选取6月龄、经PCR分子鉴定为APP+的雄性仔鼠用于实验。将28只雄性APP+小鼠(体重24～30 g)随机均分为4组，每组7只。A、B和C组小鼠口服200 μL(1次/d)远志提取物，剂量分别为50、100、200 mg/kg，持续3个月；对照组口服200 μL溶剂。

1.3 小鼠学习记忆能力检测 3个月连续干预后，采用Morris水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力。水迷宫水池直径为120 cm，高度为40 cm，共4个象限，平台直径和高度分别为15 cm、28 cm。平台首先放在第一象限，水面高度略没过平台(0.5～1.0) cm，水温控制在(25±1) ℃。首先进行6 d的空间适应性练习，小鼠在每天固定时间段内入水练习2次，每次60 s，然后开始正式实验，整个实验阶段需保持周围环境不变。空间探索实验：以组为单位将小鼠依次从水迷宫4个不同象限放入水池，采集器自动采集记录每只小鼠的运动轨迹及逃避潜伏期、穿过平台次数。反向探索实验：将平台位置对调位于第Ⅳ象限，将小鼠依次从4个不同象限放入水池，观察并记录上述指标。

1.4 小鼠海马组织中Aβ40、Aβ42含量及BACE1、γ-分泌酶活性检测 水迷宫实验结束后，处死小鼠，立即分离海马组织，在匀浆器中加入一定量的T-PER试剂(含有蛋白酶抑物)制备脑组织匀浆。匀浆经4 ℃、16 000 r/min离心1 h，收集上清液并测总蛋白浓度,用于可溶性Aβ40、Aβ42含量及BACE1、γ-分泌酶活性测定。离心后剩余的不溶物用体积分数70%甲酸溶液重悬，室温16 000 r/min离心1 h，收集上清液测定总蛋白浓度，用于检测不溶性Aβ40、Aβ42含量。ELISA操作按照试剂盒说明书进行。

1.5 小鼠海马组织中NEP、IDE与MMP-9 mRNA的检测 采用Trizol法提取海马组织总RNA，测定浓度和纯度并进行琼脂糖凝胶电泳以检测完整性。利用反转录试剂盒将1 μg 总RNA反转录为cDNA。采用ABI 7500 Real Time PCR System进行实时荧光定量PCR。每管反应体系为20 μL，每个反应重复3次。反应条件为：95 ℃30 s；95 ℃3 s，60 ℃30 s，40个循环。以β-actin作为内参基因。反应结束后观察扩增曲线和熔解曲线并记录Ct值。目的mRNA相对表达量采用2-ΔΔCt进行计算。引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列见表1。

表1 引物序列

1.6 小鼠海马组织中相关蛋白表达水平的检测 采用Western blot法。分离小鼠海马组织，液氮研磨充分，加入RIPA与PMSF(两者体积比100：1)冰上裂解，提取总蛋白，测定浓度。每个样本取300 μg总蛋白，加入Loading Buffer，100 ℃水浴10 min使蛋白变性，变性后的蛋白于-20 ℃保存或直接上样检测。每个蛋白样品依次经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转PVDF膜，封闭，加β-actin(内参)、NEP、IDE、MMP-9、BDNF、TrkB、p-TrkB、CREB、p-CREB一抗及二抗杂交，加发光剂，由成像分析系统扫描蛋白条带并测灰度值。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值×100%。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0分析数据。采用单因素方差分析比较4组间相关指标差异，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组小鼠学习记忆能力的比较 见表2。Morris水迷宫实验结果显示，与对照组相比，C组小鼠穿越平台次数增加、逃避潜伏期缩短(P均<0.05)。

表2 Morris水迷宫实验结果

*：与对照组相比，P<0.05；#：与A组相比，P<0.05；△：与B组比较，P<0.05。

2.2 4组小鼠海马组织中Aβ40、Aβ42含量比较 见表3。与对照组相比，A、B、C组小鼠海马组织中可溶性与不溶性Aβ40、Aβ42含量均下降，且B组和C组不溶性Aβ40、Aβ42含量低于A组(P均<0.05)。

表3 4组小鼠海马组织中Aβ含量 μg/g

*：与对照组相比，P<0.05；#：与A组相比，P<0.05。

2.3 4组小鼠海马组织中BACE1与γ-分泌酶活性的比较 见表4。4组BACE1与γ-分泌酶活性差异无统计学意义。

表4 4组小鼠海马组织中BACE1与γ-分泌酶活性 U/mg

2.4 4组小鼠海马组织中NEP、IDE、MMP-9 mRNA及蛋白表达水平的比较 见图2、表5。与对照组相比，A、B、C组小鼠海马组织中NEP、IDE mRNA及蛋白表达水平上调(P均<0.05)，C组上调更明显(P<0.05)；而4组MMP-9 mRNA及蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 Western blot检测小鼠海马组织中NEP、IDE及MMP-9 蛋白

表5 4组小鼠海马组织中NEP、IDE和MMP-9 mRNA及蛋白的表达

*：与对照组相比，P<0.05；#：与A组相比，P<0.05；△：与B组比较，P<0.05。

2.5 4组小鼠海马组织中BDNF/TrkB通路相关蛋白的表达水平 见图3、表6。与对照组相比，A、B、C组小鼠海马组织中BDNF、p-TrkB和p-CREB蛋白表达水平上调(P均<0.05)，其中C组上述3种蛋白表达水平上调最显著(P均<0.05)；而4组间TrkB和CREB蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。

图3 小鼠海马组织中BDNF/TrkB通路相关蛋白的表达

表6 4组小鼠海马组织中BDNF/TrkB通路相关蛋白的表达

*：与对照组相比，P<0.05；#：与A组相比，P<0.05；△：与B组比较，P<0.05。

3 讨论

Aβ由APP经β-分泌酶与γ-分泌酶切割形成，产生毒性强的Aβ40与Aβ42，可溶性Aβ40、Aβ42可直接削弱突触功能，由可溶性Aβ40、Aβ42聚合形成的不溶性Aβ40、Aβ42则主要沉积在脑部海马区和皮质区形成老年斑，损害神经元，引起认知功能障碍[8-10]。因此，减少Aβ40、Aβ42含量曾经被认为是治疗AD的策略之一。但由于AD发病机制复杂，其发病过程可能有多条通路介导，仅针对减少Aβ而设计开发的药物如分泌酶抑制剂及抗Aβ的单克隆抗体等并不能有效地改善AD的临床症状且具有一定的副作用[11-12]。

远志作为一种常见的益智类传统中药，其提取物含有远志皂苷等多种活性成分，具有安神益智、祛痰、消炎消肿等功效。近年来研究[2,5,13]发现，采用远志提取物干预可明显提高AD模型小鼠的空间学习记忆能力及降低Aβ水平，提示远志提取物用于治疗AD具有良好的应用前景。但远志提取物有效改善AD学习记忆能力及减少Aβ水平的具体作用机制目前尚不明确，且其对AD的干预效果是否与用药剂量有关目前尚无定论。因此，该研究采用不同剂量的远志提取物干预6月龄APP+小鼠持续3个月后，在从行为功能学水平和生化与分子生物学水平观察干预效果并探讨可能的作用机制。动物模型在6月龄左右开始在脑部海马区出现Aβ沉积，9月龄Aβ沉积明显增多[14]。

Morris水迷宫实验结果显示，200 mg/kg远志提取物干预APP+小鼠3个月可有效提高其学习记忆能力,表现为逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增加。各干预组小鼠海马组织中可溶性与不溶性Aβ40、Aβ42含量均低于对照组，表明远志提取物可有效降低APP+小鼠海马中的Aβ水平。为探究Aβ含量的降低是由于Aβ生成的减少还是其降解的增加，研究中进一步检测了Aβ 生成酶BACE1和γ-分泌酶的活性及与Aβ降解密切相关的3个基因NEP、IDE、MMP-9 mRNA与蛋白表达水平。结果发现，与对照组比较，各干预组小鼠海马组织中BACE1、γ-分泌酶活性及MMP-9表达水平无明显变化，而NEP和IDE表达水平显著提高。NEP和IDE均属于锌金属肽酶，研究[15]发现，随年龄的增加或给予AD小鼠NEP或IDE抑制剂，均可导致Aβ沉积。远志提取物可能通过升高NEP和IDE表达水平以促进Aβ降解，进而减少Aβ沉积。

海马组织中BDNF/TrkB通路相关蛋白检测结果显示，与对照组相比，各干预组小鼠海马组织中BDNF、p-TrkB与p-CREB蛋白的表达量增加，而TrkB与CREB蛋白表达水平无明显变化。BDNF的上调与海马神经再生及突触功能重塑关系密切，促进BDNF的表达也是干预AD等神经系统疾病的潜在策略之一。BDNF受体TrkB的活化，具有诱导神经细胞增殖和存活的作用，在神经元受损后的海马神经再生中起至关重要的作用[16]。CREB是海马神经元中许多信号通路的汇聚点，p-CREB在海马新生未成熟神经元中表达丰富，BDNF/TrkB通路的激活可导致p-CREB蛋白的增加，后者在海马神经再生的关键步骤中起重要作用[17]。近期有研究[18-19]表明，Tau蛋白的活化及Aβ含量的增加会分别抑制BDNF的表达和BDNF在海马神经元中的膜泡运输。该研究结果提示，远志提取物可能通过激活BDNF/TrkB信号通路进而促进了小鼠海马神经的再生，从而提高了小鼠的学习记忆能力。

综上所述，远志提取物可改善AD小鼠学习记忆能力，这种作用可能是通过调节BDNF/TrkB信号通路及减少Aβ沉积实现的。但远志提取物促进小鼠海马中BDNF的表达是否诱导了海马神经再生和突触重塑尚不可知，需进一步研究。

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(2016-10-25收稿 责任编辑王 曼)

PENGFang1)，CUIYuanbo2),SONGWenying1)，ZHANGJiawei1)，LIUJunbao3),GUANFangxia4)

1)DepartmentofClinicalMedicine，ZhengzhouShuqingMedicalCollege，Zhengzhou450064 2)TranslationalMedicineCenter，ZhengzhouCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity，Zhengzhou450007

3)DepartmentofTraditionalChineseMedicine，thePeople′sHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450003 4)SchoolofLifeSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001

radix polygalae;Alzheimer′s disease;learning and memory ability;mouse

Aim: To investigate the effects of radix polygalae on learning and memory ability of Alzheimer′s disease(AD) mice.Methods: A total of 28 6-month-old AD male mice were equally allocated into 4 groups(control group, group A, group B and group C). Mice in the above 4 groups took radix polygalae at the dose of 0(the same volume of solvent),50,100,200 mg/kg orally once a day for three months, respectively. Three months later, the learning and memory ability was detected by Morris water maze test; the contents of soluble and insoluble Aβ40and Aβ42, the activity of BACE1 and γ-secretase in the hippocampus were examined by ELISA; the mRNA expressions of NEP,IDE and MMP-9 were measured by quantitative real time PCR; the protein expressions of NEP, IDE, MMP-9, BDNF, TrkB, p-TrkB, CREB and p-CREB in the hippocampus were tested by Western blot. Results: Compared with the control group, the number of platforms crossing increased, and the escape latency was shortened in group C; the soluble and insoluble Aβ40and Aβ42contents in the hippocampus of group A,B,C decreased, the mRNA and protein expressions of NEP and IDE were significantly upregulated, and the expression of BDNF, p-TrkB and p-CREB proteins in the hippocampus increased(P<0.05); the changes of the indexes mentioned above of group C improved significantly than group A and B(P<0.05). While the activity of BACE1 and γ-secretase, and MMP-9, TrkB, CREB expressions in the hippocampus showed no significant differences among the 4 groups(P>0.05). Conclusion: Radix polygalae could improve the learning and memory ability of AD mice, and degradation of Aβ and regulating BDNF/TrkB signaling pathway might be the possible molecular mechanism.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.008

*河南省科技厅重大攻关项目 12210130200

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