角膜黏弹性定量测量评估胶原交联处理效果

张鹏鹏，高雪华，王青敏，吕 振，张新宇

医学超声关键技术国家地方联合工程实验室, 广东省生物医学信息检测与超声成像重点实验室,深圳大学医学部，深圳 518060

【电子与信息科学 / Electronics and Information Science】

角膜黏弹性定量测量评估胶原交联处理效果

张鹏鹏，高雪华，王青敏，吕 振，张新宇

医学超声关键技术国家地方联合工程实验室, 广东省生物医学信息检测与超声成像重点实验室,深圳大学医学部，深圳 518060

建立基于VerasonicsTMVantage256 超声开放系统的实验平台，用声辐射力激励角膜振动，通过快速平面波成像检测A0模式兰姆波的传播，根据兰姆波的频散特性估计牛眼角膜的剪切弹性模量和剪切黏性系数．通过对牛眼角膜进行离体实验研究，评估紫外线-核黄素角膜胶原交联术(corneal collagen cross-linking, CXL)中加入戊二醛和不同紫外线照射时间的影响．结果表明，加入质量分数为0.1%的戊二醛对角膜的硬化效果较未加入的更强．加入质量分数为0.1%的戊二醛的CXL处理组，紫外线照射5、10、30和60 min对应的杨氏模量比直接CXL处理组的弹性值分别增大了148.78%、335.68%、392.59%和250.47%．

生物医学测量学；医学超声；超声弹性成像；声辐射力；角膜；黏弹性；胶原交联处理

角膜是眼睛最前面的透明部分，覆盖虹膜、瞳孔及前房．角膜从外到内可分为上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层，其光学特性和力学特性对维持眼球功能起着重要作用．圆锥角膜疾病，是以角膜中央变薄向前突出，呈圆锥形特征的一种眼病，包括原发性圆锥角膜和角膜屈光手术后继发性角膜膨隆．其中，以原发性圆锥角膜为典型代表，发病率达0.05%[1]，常造成高度不规则近视散光和不同程度的视力损害，现是角膜移植的第二常见指征．角膜胶原交联术(corneal collagen cross-linking, CXL)[2]是目前唯一确认阻止圆锥角膜病变进展的治疗手段．CXL经过十余年发展，在欧洲已成为临床治疗圆锥角膜的常规手段，中国还在临床推广中．中国作为角膜植片严重匮乏、广泛大量开展角膜屈光手术、严重感染性角膜炎仍是主要致盲因素之一的国家，倡导并推动该技术在眼科的研究和临床应用，具有重要社会意义[3]．角膜生物力学特性的在体定量测量研究可用于圆锥角膜疾病的诊断及CXL术后效果评估，为CXL技术的应用和推广提供了技术保障．

早期角膜力学特性测量主要采用拉伸实验[4]及眼球膨胀测试[5]等离体实验研究．目前美国Reichert公司的眼反应分析仪 (ocular response analyzer，ORA)和德国Oculus公司推出的Corvis ST角膜生物力学分析仪都已用于临床，提供与角膜整体力学特性有关的参数．对角膜的力学特性进行高分辨率成像的方法也有较快的进展，如电子散斑干涉法[6]、布里渊光学显微镜[7]、光学相干弹性成像法[8]和超声弹性成像法[9]．这些方法的原理和实现方式各不相同，目前基本处在离体实验阶段．其中，电子散斑干涉法和光学相干弹性成像需通过外加机械力使角膜振动，再分别用散斑成像技术或光学相干断层扫描技术(optical coherence tomography, OCT)技术追踪角膜的振动，估计其力学特性；超声弹性成像可用同一探头激励角膜振动并检测，但探头和角膜间需要水作为耦合剂．布里渊显微镜法根据焦点处的布里渊频移与硬度的相关性评估组织硬度，但是完成一次测量时间较长．Tanter等[9]将剪切波弹性成像(supersonic shear imaging,SSI)技术应用于角膜，根据简化模型估计角膜的杨氏模量．Zhang等[10]提出基于兰姆波频散特性的超声弹性成像方法定量估计角膜的黏弹性特性．

本研究建立了基于VerasonicsTMVantage256 超声开放系统，实现了角膜黏弹性估计算法，并设计了两种CXL方案处理角膜，使用所建立的系统平台分别测量两种方案处理后角膜的黏弹性变化，定量评估两种CXL方案处理后角膜的硬化效果．

1 方法原理

1.1 原 理

本研究基于兰姆波在角膜组织中传播的原理，使用超声方法激励并检测兰姆波的传播特性，估算出角膜的黏弹性．弹性波在无限长薄板中的传播模式被命名为兰姆波，被广泛用于导波在圆柱壳内传播的研究中[11]．Kanai[12]将漏兰姆波的频散特性方程进行近似变形，用于估计心脏血管壁的黏弹性．本研究将超声辐射力触发角膜产生的弹性波近似为兰姆波．兰姆波的传播模式具有高频散的特性，在低频范围(对角膜低于2 kHz)内仅2种模式：零阶对称模式(zero-order symmetric mode，S0)与零阶反对称模式(zero-order asymmetric mode，A0)，其中，A0模式振幅大且呈现出明显的频散特性．Kanai[12]假设心室壁为厚度2h的黏弹性薄板且密度与周围液体相近，并假设心室壁中纵波的波数远小于兰姆波的波数，对漏兰姆波的频散特征方程进行近似化简，提出兰姆波在心室壁中传播的频散特性方程为

(1)

其中，ω为角频率；cL(ω)和cS(ω)分别为角频率为ω时的A0兰姆波和对应剪切波的相速度；KL=ω/cL(ω)和Ks=ω/cs(ω)分别为兰姆波和剪切波的波数，且

(2)

角膜同样满足Kanai提出的假设．因此本研究采用方程(1)描述角膜内A0兰姆波传播特性，并引入Voigt模型(由弹簧和阻尼器并联组成)描述角膜的黏弹性，则有

μ=μ1+iωμ2

(3)

其中，μ1和μ2分别为剪切弹性和剪切黏性．对于Voigt材料，剪切波波数Ks取决于μ1和μ2， 如

(4)

其中，ρ是角膜组织的密度．

将式(4)代入方程(1)可得到兰姆波速度、频率、角膜厚度2h、 及μ1和μ2的方程式

f(cL，μ1，μ2，ω，h)=0

(5)

取h等于实测角膜厚度的1/2．设角膜密度ρ≈1.0×103kg/m3，根据实测的兰姆波相速度，采用非线性优化方法解方程(5)的逆问题，得到μ1和μ2的估计值．算法的基本思想是遍历<μ1,μ2>的组合，对于每一组<μ1,μ2>， 代入式(5)得到各频率下兰姆波相速度的理论值,找到使估计的相速度与实测相速度cL(ω)之间的误差平方和最小的<μ1,μ2>组合，作为μ1和μ2的估计．即

(6)

1.2 超声测量平台搭建

基于VerasonicsTMVantage256开放性可编程超声系统构建如图1的实验平台．Vantage256系统可通过Matlab环境下的脚本程序，独立控制各通道发射和接收，实时访问各通道射频信号(radiofrequency，RF)数据，并对数据进行处理和分析．平台采用128阵元的线阵探头(L11-4)，对眼球进行B-mode超声成像及超声弹性测量．B-mode图像用于弹性测量的引导，方便确定测量位置．在弹性成像模式下，系统控制多个阵元的超声波发射产生聚焦的声辐射力，打击测量点处的角膜，然后使用快速平面波成像方式检测组织的振动信息和波的传播．

图1 超声实验过程中眼球与探头的关系及角膜组织振动位移信息Fig.1 Relationship between eyeball and probe, and vibration displacement information of corneal tissue during ultrasonic experiment

1.3 角膜样本处理

实验所用新鲜完整的牛眼球取自深圳市南山肉联厂．CXL方法可分为物理类交联和化学类交联[13]．物理类交联方法主要有核黄素加紫外光诱导和玫瑰红加绿光诱导交联反应两种；化学交联方法主要有利用甘油醛产生非酶糖基化作用硬化角膜和化学试剂戊二醛硬化作为交联剂两种．本研究使用两种CXL方案对离体角膜样本进行硬化，比较处理前后的黏弹性测量结果：方案1是紫外光核黄素(UVA-riboflavin)法，角膜表面涂覆质量分数为0.1%的核黄素，并给予一定平常的紫外光照射；方案2是在方案1的配方中额外加入质量分数为0.1%的戊二醛(glutaraldehyde)增强硬化效果．两方案中未做CXL处理的角膜均被划分为空白对照组(未作任何处理)，去上皮对照组(仅刮除上皮层)，CXL处理的角膜按照紫外光照射的时长分为5、10、30和60min组，共6个分组．两个方案中使用眼球样本数(n)如表1，每个样本都使用角膜测厚仪(SP-100，TOMEY，Japan)测量记录处理后的角膜厚度来进行角膜黏弹性拟合．

紫外光核黄素CXL胶原交联溶液配制方法为：

1)备好浓度为0.1mol/L，pH=7.4的磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuffersaline，PBS)；

2)把粉末状葡聚糖溶入所配置的PBS缓冲液中，得到质量分数为20.0%的葡聚糖溶液．(方案2中缓冲液里额外加入质量分数0.1%的的戊二醛)；

3)葡聚糖溶液中加入质量分数为0.1%的核黄素，配成胶原交联溶液．

两种方案的处理步骤为：

1)刮除角膜上皮，点涂葡聚糖溶液后静置1h；

2)角膜在胶原交联溶液中浸泡5min，紫外光下根据各小分组的要求定时照射，间隔5min点涂一次交联溶液湿润角膜；

表1 超声检测角膜分组标号及样本个数

3)暗箱内静置45 min，然后用清水清洗角膜表面残留溶液，用于测量．

1.4 离体超声测量过程及数据处理

实验中将完整眼球固定并浸于纯水中，固定探头，选取角膜顶点为测量点，一次完整的角膜生物力学测量过程为：快速平面波采集10帧静态角膜数据，声辐射力激励角膜1次，延时240 μs，快速平面波采集500帧数据，处理显示角膜组织振动位移曲线、兰姆波群速度与兰姆波频散分布，保存数据．其中，声辐射力使用了35个阵元聚焦，发射频率为4 MHz的正弦波500个周期，激励电压最大为58 V；快速平面波采集模式中128个通道同时发射中心频率为6.25 MHz的短脉冲并接收回波信号，最大电压为70 V，脉冲重复频率为10 kHz，采集500帧的角膜振动数据．

对RF数据进行正交解调，参照脉冲多普勒的方法从两正交信号中提取角膜振动的信息．根据振动传播路径上各点的位移，计算兰姆波的群速度和相速度．

每个样本采集6组数据，计算对应的相速度均值，得到兰姆波在角膜组织中的传播频散特性，结合式(5)估计对应的角膜的剪切弹性和剪切黏性值．本研究主要比较各组角膜的兰姆波频散曲线及黏弹性的估计值．用方差分析法(analysis of variance, ANOVA)分析组间均值差异的显著性．

2 结果与讨论

2.1 两种方案对应各分组的频散曲线

方案1各小组的兰姆波相速度的均值与方差曲线如图2．图2显示R5、R10和R30组的频散曲线几乎重合；RC组各频率相速度明显低于其他各组，RCE组与其他各组的差异也非常明显，R60组各频率相速度均明显高于其他组．

方案2各组角膜样本的兰姆波在200～1 050 Hz上相速度频散曲线如图3．由图3可见，频散曲线自GC、GCE、G5、G10和G30各组逐渐升高，各组之间差距明显．

图2 方案1各分组对应的兰姆波速度频散曲线Fig.2 Lamb wave velocity dispersion curves of the groups in CXL scheme 1

图3 方案2各分组兰姆波速度频散曲线Fig.3 Lamb wave velocity dispersion of the groups in CXL scheme 2

2.2 两种方案的剪切弹性估计对比

由每个样本6次测量得到的各频率下相速度平均值和角膜厚度测量值，估计出基于Voigt模型的弹性模量μ1和黏性系数μ2． 将μ1和μ2代入式(5)，得到兰姆波相速度的理论值．相对误差=(理论值-实测值)/实测值×100%，对于所有样本的相速度，相对误差在(7.66±9.09)%，说明理论兰姆波波速与实测结果吻合较好．

两种方案各6个分组的剪切弹性箱线图如图4．对比两方案分别对应的组别结果发现，两个方案中正常对照组与去上表皮组对照组的弹性结果非常吻合；方案1中R5、R10、R30和R60组别的弹性值比方案2中对应的G5、G10、G30和G60组别的弹性值分别增了148.78%、335.68%、392.59%和250.47%．方差分析显示，10、30和60min组两种方案的弹性具有显著性差异(P<0.05)， 表明方案2对角膜硬化程度明显强于方案1．

图4 方案1与方案2对应的各分组弹性值箱线图分布图Fig.4 Boxplots of estimated shear elasticity for all groups

方案1中各组方差分析结果显示，R5与R10，R10与R30组无显著差异，其余相邻各组均有显著差异，说明这6组弹性值呈递增趋势．方案2的弹性方差分析结果显示，仅G5组与G10组间无显著差异，其余各组均有显著差异．

2.3 两种方案的剪切黏性估计对比

两种方案对应的黏性结果显示，两方案空白对照组中的黏性值均明显大于各处理组中的黏性值，处理后黏性值数量级非常小且变化不大．处理后黏性均变小，但各分组间无显著差异．

由表2两方案6组的黏性结果可见，空白对照组黏性最大，去上皮对照组黏性降低1～2个数量级，CXL处理后黏性又下降1～2个数量级，但与紫外光照射时间无明显相关．

2.4 结果的讨论

CXL处理中致密的上皮层会阻碍药物的渗透，影响交联效果，一般都会刮除去上皮后再进行CXL处理，因此本研究在对照组中设置了去上皮对照组．由于角膜是具有多层结构，且每层的力学特性各不相同．因此，空白对照组和去上皮对照组的黏弹性差异主要反映了上皮层对测量结果的影响．而去上皮对照组与CXL处理后各组之间的差异体现了CXL处理对角膜力学特性的改变．

表2 两方案角膜处理方式中的各分组黏性均值±s)

Tanter等[14]用SSI法测量到正常猪眼角膜的杨氏模量为(190±32)kPa，经UVA-riboflavinCXL处理的角膜杨氏模量为(890±250)kPa，增大了460%．Urs等[15]研究结果表明，经过CXL处理后兔眼角膜硬度明显增大．Scarcelli等[16]用组织的Brillouin模量来评估角膜经过核黄素-紫外光诱导胶原交联后角膜弹性变化，发现在CXL处理角膜时，若浸泡时间不变，紫外光照射时间越长，得到处理后角膜Brillouin模量越大．本研究对牛眼球施以两种胶原处理，结果表明，处理后角膜弹性比未处理的角膜弹性显著增大，并随紫外光照射时间的延长弹性逐渐增大，与文献[14-16]报道吻合．

在核黄素溶液中加入戊二醛，相当于同时施加了化学交联和物理交联，目的是获得更强的硬化效果，以评价本研究对角膜硬度的区分能力．Avila等[17]通过对离体猪眼球的眼压变化与体积变化获取到对应的眼壁硬度系数，对应的质量分数为0.1%的戊二醛法与紫外光核黄素法处理后离体猪眼球眼壁硬度结果为1 227kPa/L与867kPa/L，即处理相同时间，戊二醛处理角膜硬化效果比紫外光核黄素法效果更好．本研究结果显示，两种CXL处理方案中，加入戊二醛对角膜的硬化效果更显著，CXL处理后的黏性显著降低．目前尚未见用相似原理进行实验定量估计角膜黏性系数的报道，但有研究发现胶原交联导致硬度增加而黏性降低[18-19]．

上述离体实验的结果表明，该超声测量方法均可定量区分出对照组与处理组间的角膜生物力学特性变化，不仅能区分出同一配方不同照射时间引起弹性的改变，还可区分出两方案对弹性改变的差异．该方法使用同一线阵探头完成声辐射力激励和检测扫描，简单便捷，有望成为商用超声系统的附加功能．

结 语

本研究基于超声弹性成像原理，提出一套基于兰姆波频散特性估计角膜黏弹性的方法和系统，评价了两种CXL方案对角膜处理的交联效果，结果显示，经过CXL处理后弹性增大，黏性降低．方案2处理组紫外光照射5、10、30和60min组的弹性值比方案1中处理组弹性值分别增大了148.78%、335.68%、392.59%和250.47%，表明该超声方法可很好地定量区分不同CXL处理方法改变角膜硬度的效果，未来有望用于对胶原术治疗圆锥角膜的评估．下一步将着眼于测量准确性的验证、黏性估计的价值、系统的优化、能量安全性评估和在体动物实验研究．

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【中文责编：英 子；英文责编：子 兰】

2017-04-12；Accepted：2017-04-29

Associate professor Zhang Xinyu. E-mail: xyzhang9@szu.edu.cn

Assessing the effect of collagen cross-linking by quantitative measurement of corneal viscoelasticity

Zhang Pengpeng, Gao Xuehua, Wang Qingmin, Lyu Zhen, and Zhang Xinyu

National-Regional Key Technology Engineering Laboratory for Medical Ultrasound, Guangdong Key Laboratory for Biomedical Measurements and Ultrasound Imaging, Health Science Center, Shenzhen University, Shenzhen 518060, P.R.China

This study establishes an experimental platform based on VerasonicsTMVantage 256 ultrasonic open system, and uses the acoustic radiation force to excite the corneal vibration and uses plane wave imaging to detect A0 mode Lamb wave. The corneal shear elastic modulus and shear viscosity are estimated based on Lamb wave dispersion characteristics. In order to validate the effectiveness of this system, two kinds of CXL treatments are introduced to treat bovine corneas, and the effect of the treatment with different reagent and UV exposure duration are evaluated. The results show that the CXL with the addition of glutaraldehyde (0.1% mass concentration) in riboflavin solution induces significantly higher increase in elasticity in comparison with those without glutaraldehyde. The elasticity of the group with glutaraldehyde after 5, 10, 30 and 60 min UVA exposure increases by 148.78%、 335.68%, 392.59% and 250.47%, respectively, in comparison with the groups without glutaraldehyde.

biomedical measurement; medical ultrasound; ultrasound elastography; acoustic radiation force; cornea; viscoelasticity; collagen cross-linking

：Zhang Pengpeng, Gao Xuehua, Wang Qingmin, et al. Assessing the effect of collagen cross-linking with quantitative measurement of corneal viscoelasticity [J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2017, 34(4): 428-433.(in Chinese)

R 318.01; R 445.1

A

10.3724/SP.J.1249.2017.04428

国家自然科学基金资助项目(61101025，81570552)；深圳市基础研究基金资助项目 (JCYJ20150625102427087)

张鹏鹏(1991—)，男，深圳大学硕士研究生.研究方向：医学超声．E-mail：ZhangPengpengSZ@163.com

Foundation：National Natural Science Foundation of China(61101025，81570552)；Shenzhen Basic Research Project(JCYJ20150625102427087)

引 文：张鹏鹏，高雪华，王青敏，等．角膜黏弹性定量测量评估胶原交联处理效果[J]. 深圳大学学报理工版，2017，34(4)：428-433.