巨噬细胞中FBW7沉默对其杀菌能力的抑制

孙锦霞，黄 钟，王 瑞，翁林军，李亚旭

1)深圳大学医学部，广东深圳518060；2)聊城大学药学院，山东聊城252059；3)同济大学生命科学与技术学院，上海200092

【生物工程 / Bioengineering】

巨噬细胞中FBW7沉默对其杀菌能力的抑制

孙锦霞1，黄 钟1，王 瑞2，翁林军3，李亚旭3

1)深圳大学医学部，广东深圳518060；2)聊城大学药学院，山东聊城252059；3)同济大学生命科学与技术学院，上海200092

采用小干扰核糖核酸(siRNA)介导Hela细胞、原代巨噬细胞和RAW264.7细胞中FBW7基因沉默，研究其对NF-κB信号通路、细胞因子表达、巨噬细胞吞噬和杀伤细菌能力的影响．通过流式细胞术、抗生素保护试验、实时荧光定量聚合酶链式反应和报告基因的研究方法，发现FBW7沉默不具有调控RAW264.7细胞吞噬细菌的能力，但能显著抑制原代巨噬细胞和RAW264.7细胞的杀菌能力及一氧化氮合成酶(nitricoxidesynthase,iNOS)表达，抑制Hela中NF-κB报告基因活性，降低Hela细胞中TNFα、IL-1β和IL-6， 以及原代巨噬细胞、RAW264.7细胞中MCP-1和IL-1β表达．结果表明，FBW7沉默可通过影响NF-κB活性抑制巨噬细胞对细菌的杀伤能力．

小干扰核糖核酸；RAW264.7细胞；巨噬细胞；杀菌活性；一氧化氮合成酶；NF-κB信号通路；实时荧光定量聚合酶链式反应

尽管目前已有大量抗生素被应用于临床，细菌性感染仍威胁着人类的健康[1]．巨噬细胞是固有免疫应答中的主要效应细胞，在感染早期发挥主导作用[2-3]．一方面，巨噬细胞借助其表面的模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)识别感染部位的病原微生物，发挥非特异性吞噬杀伤作用．另一方面，巨噬细胞通过激活细胞内NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等一系列信号通路，导致大量细胞因子(如TNFα、IL-1β和IL-6 )、趋化因子(如MCP-1和MIP-1α)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(nitric oxide，NO)等的表达释放，募集更多的免疫细胞至感染部位，从而扩大局部抗感染免疫反应，保护机体免受损伤．E3泛素连接酶FBW7在炎症反应、肿瘤发生等生理病理进程中发挥至关重要的调节作用[4]．RAW264.7细胞是小鼠白血病单核巨噬细胞系，具有高效的脱氧核糖核苷酸(deoxyribonucleic acid，DNA)转染和核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)干扰效率，被广泛用于研究巨噬细胞介导的炎症反应、吞噬杀伤细菌能力及调控机制．本研究探讨小干扰核糖核酸(small inferfering RNA，siRNA)介导的FBW7沉默对巨噬细胞杀伤细菌能力、NF-κB活性及下游细胞因子表达的作用，以阐明E3泛素连接酶FBW7对细菌杀伤能力的调节作用及调控机制．

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

DMEM(dulbecco’smodifiedeaglemedium) 细胞培养基、胎牛血清和胰酶购自美国Gibco公司；庆大霉素购自美国MerckMillipore公司；2×台盼蓝染色液购自上海碧云天生物技术有限公司；Lipofectamine2000和RNA提取试剂Trizol购自美国Invitrogen公司；Trans-EZ转染试剂购自上海麒盟生物科技有限公司；FugenHD转染试剂购自美国Roche公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；TNFα细胞因子购自美国PeproTech公司；脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和巯基乙酸盐培养基购自美国Sigma公司；反转录和PCR相关试剂购自日本Takara公司；乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)、Triton-X100、无水乙醇、异丙醇、LB(luria-bertani)培养基等化学试剂购自上海生工生物工程股份有限公司；Nanodrop微量分光光度计购自美国Thermo公司；荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；流式细胞仪购自美国BD公司．

1.2 细胞培养与转染

用DMEM培养基(含有体积分数为10% 的胎牛血清)培养Hela细胞、原代腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞．给8～12周C57BL/6小鼠注射3mL体积分数为3%的巯基乙酸盐培养基，3d后腹腔注射5mLPBS(phosphatebuffersolution)缓冲液，提取腹腔巨噬细胞，CO2培养箱中贴壁2h后，换为新鲜培养基，用于后续实验．本研究所用siRNA序列为：鼠siFBW7： 5′-ACCUUCUCU-GGAGAGA-GAAAUGCTT-3′；人siFBW7： 5′-GGCA-CUCUAUGUGCUUUCAUUC-3′．

上述siRNA由上海吉玛公司合成后，经Lipofectamine2000转染至Hela细胞和原代巨噬细胞，或经FugenHD转染至RAW264.7细胞，质粒转染使用Trans-EZ转染试剂．

1.3 吞噬和抗生素保护试验

LB液体培养基培养可表达绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)的大肠杆菌(escherichiacoli，E.coli)至对数生长期， 光密度D(600)值约为0.4～0.6，加入1mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside，IPTG)，25 ℃培养过夜，诱导GFP表达，获得GFP标记的E.coli，此时菌液浓度约为1×106mL-1．离心收集细菌，然后PBS清洗2遍，DMEM培养基(含有体积分数为10% 的胎牛血清)稀释至所需浓度．吞噬实验细胞数量n(E.coli)∶n(RAW264.7)=8∶1，APA实验细胞数量比n(E.coli)∶n(原代巨噬细胞RAW264.7)=4∶1，加入稀释后的E.coli， 1 800r/min离心10min．37 ℃共培养2h后PBS清洗2遍，然后加入DMEM培养基(含有体积分数为10% 的胎牛血清和10mg/mL庆大霉素)培养30min，以杀伤细胞表面的E.coli． 吞噬试验换为台盼蓝染色液，孵育10min以淬灭细胞表面荧光，然后直接收集细胞，通过流式细胞术检测，并用FlowJo软件分析GFP阳性率．APA试验需要换为DMEM培养基(含有体积分数为10% 的胎牛血清和5mg/mL庆大霉素)继续共培养4h，最后加入胰酶(含有体积分数为0.5%的EDTA和体积分数为0.025%的Triton-X100)裂解细菌．裂解液经梯度稀释后涂于LB固体培养皿，第2天统计所长出单克隆数目．

1.4RNA提取和RT-PCR

细胞经Trizol裂解提取总mRNA后，将不同样品的mRNA含量调整一致后反转录为互补脱氧核糖核酸(complementarydeoxyribonucleicacid，cDNA)，于-20 ℃保存，用于后续PCR实验．本研究所用引物序列见表1.

表1 RT-qPCR所用引物

上述引物经上海赛百盛基因技术有限公司合成，按DNA聚合酶说明书进行PCR扩增，所得产物经琼脂糖凝胶电泳检测，或按SYBR试剂盒进行荧光定量PCR扩增，所扩增的PCR产物经溶解曲线检验，目的基因扩增产物与看家基因β-actin比较，经2-ΔΔct方法计算出该基因信使核糖核酸(messengerribonucleicacid，mRNA)的相对表达量．

1.5 统计学方法

2 结果与分析

2.1FBW7沉默不影响细胞对细菌的吞噬能力

为检测FBW7沉默对RAW264.7细胞杀菌能力的调控作用，本研究首先检测其对RAW264.7细胞吞噬细菌能力的影响．siNC(negativecontrol)和siFBW7转染72h，裂解细胞并提取RNA，反转录后PCR检测FBW7表达的变化．同时按细胞数量n(E.coli)∶n(RAW264.7)=8∶1加入GFP标记的E.coli， 通过流式细胞术检测FBW7沉默对RAW264.7细胞吞噬细菌能力的影响，结果如图1．siFBW7转染72h可以显著沉默RAW264.7细胞FBW7mRNA水平表达，如图1(a)和(b) ．但是，流式细胞术检测结果显示，FBW7沉默对RAW264.7细胞吞噬细菌的能力没有影响，如图1(c)、(d)和(e)．

2.2FBW7沉默会抑制杀菌能力和iNOS表达

siFBW7转染腹腔原代巨噬细胞72h，裂解细胞并提取RNA，反转录后PCR检测FBW7mRNA水平表达的变化．此外，siFBW7转染72h后，按细胞数量n(E.coli)∶n(原代巨噬细胞)=4∶1加入GFP标记的E.coli， 通过抗生素保护试验检测FBW7沉默对原代巨噬细胞杀菌能力的影响，结果如图2． siFBW7转染72h可以显著沉默原代巨噬细胞中FBW7mRNA水平表达，如图2(a)和(b)，并且FBW7沉默显著抑制了原代巨噬细胞的杀伤细菌能力，如图2(c)和(d)．

总之，只有严格遵守纪律，坚决执行，才能够做成事情。根本的东西搞清楚了，努力方向有了，工作方法有了，思想指导行动，执行才更有力。

图1 FBW7沉默对RAW264.7吞噬细菌能力的影响Fig.1 Effect of FBW7 silence on uptaking activity of RAW264.7

图2 FBW7沉默对巨噬细胞杀伤细菌能力的影响Fig.2 Effect of FBW7 silence on bactericidal activity of macrophage

此外，通过抗生素保护试验实验进一步研究RAW264.7细胞中FBW7沉默对其杀菌能力的影响．结果表明，与原代巨噬细胞结论一致，RAW264.7中FBW7沉默也显著抑制了其杀伤细菌的能力，如图2(e)和(f)．

已知NO在吞噬细胞杀伤细菌过程中的重要作用，本研究进一步检测了FBW7沉默对iNOS表达的调节作用．siFBW7分别转染原代巨噬细胞和RAW264.7细胞72h，加入LPS(1μg/mL)刺激细胞4h，裂解细胞并提取RNA，反转录后PCR检测iNOS表达变化．结果表明，FBW7沉默显著抑制原代巨噬细胞和RAW264.7中iNOS表达，如图2(g)和(h)．

2.3Hela细胞中FBW7沉默可抑制NF-κB活性

已知iNOS是NF-κB信号通路的靶基因，为研究siFBW7与NF-κB的关系，本研究通过报告基因的方法揭示siFBW7对NF-κB的调控作用．首先，Hela细胞转染siFBW7 48h，裂解细胞并提取RNA，反转录后PCR检测FBW7表达的变化．然后，转染NF-κB-luciferase和Renilla质粒于Hela细胞，24h后加入TNFα(10ng/mL)刺激4h，根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒裂解细胞并收集上清，分别检测Luciferase和Renilla活性，结果如图3．其中，siFBW7转染72h可显著沉默FBW7表达，见图3(a)和(b)，Hela细胞中FBW7沉默显著抑制NF-κB活性，见图3(c)．

图3 FBW7沉默对NF-κB报告基因活性的影响Fig.3 Effect of FBW7 silence on NF-κB report gene activity

2.4FBW7沉默显著抑制细胞因子的表达

为明确FBW7沉默对NF-κB活性的抑制作用，检测了其下游其他靶基因的表达变化．siFBW7 转染Hela72h，加入TNFα(10ng/mL)刺激4h．随后裂解细胞并提取RNA，反转录后PCR检测细胞因子表达的变化，结果如图4(a)至(c)．FBW7沉默显著抑制Hela细胞中TNFα、IL-1β和IL-6的表达．

为研究siFBW7在巨噬细胞中对NF-κB下游其他靶基因的表达，siFBW7转染原代巨噬细胞和RAW264.7细胞72h，分别加入LPS(1μg/mL)刺激4h，通过PCR检测细胞因子表达的变化，结果如图4(d)至(g)．FBW7沉默显著抑制原代巨噬细胞和RAW264.7细胞中MCP-1、IL-1β的表达．

图4 FBW7沉默对Hela和巨噬细胞中促炎因子表达的影响Fig.4 Effect of FBW7 silence on cytokines expression in Hela and macrophage

3 讨 论

巨噬细胞的非特异性吞噬杀伤作用在清除感染的病原菌过程中发挥着重要作用，关于巨噬细胞杀菌机制的研究目前已有很多，主要包括溶酶体途径杀菌、抗菌肽、ROS和NO等．iNOS是NF-κB信号通路的一个靶基因，其产物NO不仅可以抑制细菌的DNA复制，也能通过影响氧化作用加速DNA损伤，最终发挥抗菌活性[5-7]．本研究首次证明FBW7沉默可以显著下调RAW264.7细胞对E.Coli的杀伤能力和杀菌过程至关重要因子iNOS的表达，且对RAW264.7吞噬细菌的能力没有影响．提示FBW7可能在巨噬细胞抵抗细菌性感染中发挥至关重要的作用，为临床上细菌感染药物研发提供了新的靶点，但其具体的分子调节机制尚待深入研究．

FBW7通过泛素化降解多种原癌蛋白发挥抑癌作用，如c-Myc[8-9]、cyclinE[8-9]、Notch1[10-11]、KLF5[12]和KLF2[13]等，其突变与肿瘤发生和预后密切相关．研究表明，FBW7与NF-κB信号通路可以相互调节，如FBW7通过泛素化降解NF-κB2调节NF-κB的活性[14-15]，而NF-κB1作为FBW7的上游，抑制其表达及其底物c-Myc的降解[16]．此外，FBW7通过下调C/EBPδ抑制巨噬细胞中TLR4基因表达[17]，从而抑制LPS介导的炎症信号，腹腔注射siFBW7α后可以上调腹腔巨噬细胞中p65、iNOS和IL-6等本底水平的表达．因此，FBW7在巨噬细胞介导的炎症反应中发挥至关重要的调节作用．

关于FBW7与细菌感染或巨噬细胞杀菌能力之间的关系尚未证明．本研究发现，FBW7沉默显著抑制NF-κB活性，且下调Hela和巨噬细胞中NF-κB信号通路靶基因TNFα、IL-1β、IL-6、MCP-1和iNOS的表达．因此，FBW7沉默可能通过调节NF-κB信号通路活性抑制巨噬细胞对细菌的杀伤能力．但关于FBW7调节NF-κB信号通路的分子机制尚需进一步验证．此外，FBW7对巨噬细胞杀菌能力的影响或机体抵御细菌感染的调控作用及分子机制仍需进一步验证，或使用FBW7敲除小鼠及建立脓毒症模型进行深入研究．总之，本研究结果从另一角度证明了FBW7在炎症反应中的重要作用，为深入研究FBW7对脓毒症的调控奠定了基础．

结 语

脓毒症是临床上常见的一种并发症，细菌性感染为主要诱因．巨噬细胞作为抗感染过程中的关键性免疫细胞，在固有免疫反应中发挥重要作用．巨噬细胞中FBW7沉默可能通调节NF-κB活性而抑制其杀伤细菌的能力，后续仍需深入研究FBW7对杀菌活性及NF-κB活性调控的分子机制．

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【中文责编：晨 兮；英文责编：艾 琳】

2016-11-05；Revised：2017-02-28；Accepted：2017-05-07

Professor Huang Zhong. E-mail: zhuang809@126.com

The anti-bactericidal effects ofFBW7 silence in macrophage

Sun Jinxia1, Huang Zhong1, Wang Rui2, Weng Linjun3, and Li Yaxu3

1) Health Science Center, Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong Province, P.R.China 2) College of Pharmacy, Liaocheng University, Liaocheng 252059, Shandong Province, P.R.China 3) School of Life Science and Technology, Tongji University, Shanghai 200092, P.R.China

SiRNA-mediatedFBW7silenceinHela,primarymacrophageandRAW264.7wereperformedtoassaytheroleofFBW7onNF-κBactivity,cytokinesexpressionandphagocytosisandbactericidalactivityofmacrophage.Flowcytometry(FCM),antibioticprotectionassay(APA),realtimequantitativepolymerasechainreaction(RT-qPCR)andreportgeneanalysissuggestthatFBW7silencedoesnotaffectphagocytosisofRAW264.7,butsignificantlyinhibitsbactericidalactivityandnitricoxidesynthase(iNOS)expressioninprimarymacrophageandRAW264.7,suppressesNF-κBreportgeneactivityinHela,decreasesexpressionofTNFα、IL-1β、IL-6inHelaandMCP-1、IL-1βinprimarymacrophageandRAW264.7.Thus,FBW7silencemightinhibitbactericidalactivityofmacrophagebyregulatingNF-κBactivity.

small interfering RNA (siRNA); RAW264.7; macrophage; bactericidal activity; nitric oxide synthase (iNOS); NF-κB signaling pathway; real time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR)

：Sun Jinxia, Huang Zhong, Wang Rui, et al. The anti-bactericidal effects ofFBW7silenceinmacrophage[J].JournalofShenzhenUniversityScienceandEngineering, 2017, 34(4): 358-363.(inChinese)

R

A

10.3724/SP.J.1249.2017.04358

国家自然科学基金资助项目(31401217)；中国博士后科学基金资助项目(2014M0560672)

孙锦霞(1986—)，女，深圳大学博士后研究人员. 研究方向：免疫学.E-mail：jinxia8608@126.com

Foundation：National Natural Science Foundation of China (31401217); Postdoctral Science Foundation of China (2014M0560672)

引 文：孙锦霞，黄 钟，王 瑞，等. 巨噬细胞中FBW7沉默对其杀菌能力的抑制[J]. 深圳大学学报理工版，2017，34(4)：358-363.