快速超广谱β-内酰胺酶筛查在尿路感染中的应用价值研究

王宪灵 王缚鲲 赵会海 张盼 贾克然 张海谱

·论著·

快速超广谱β-内酰胺酶筛查在尿路感染中的应用价值研究

王宪灵 王缚鲲 赵会海 张盼 贾克然 张海谱

目的 探讨快速超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)筛查实验在住院尿路感染(urinary tract infection，UTI)患者中的应用价值，为及时有效治疗UTI提供依据。方法 快速ESBLs筛查实验采用液体培养基添加头孢噻肟比浊法测定。UTI患者送检中段尿培养标本1 160份，离心镜检分为可疑革兰阴性杆菌感染组(502例)，可疑革兰阳性球菌感染组(103例)，可疑念珠菌感染组(15例)，可疑混合感染组(85例)，可疑阴性组(431例)。采用ESBLs快速筛查方法和ESBLs确认实验方法分别对其中的可疑革兰阴性杆菌感染组、可疑混合感染组和可疑阴性组进行检测，比较两种方法的差异。结果 在可疑革兰阴性杆菌感染组、可疑混合感染组和可疑阴性组3组，ESBLs确认试验共检测到产ESBLs菌株阳性标本346例(33.21%)，快速ESBLs筛查试验共检测到产ESBLs菌株阳性标本386例(37.04%)，两者阳性率比较差异无统计学意义(χ2=3.369，P=0.066)。在可疑革兰阴性杆菌感染组，两者的符合率为84.03%，快速ESBLs筛查试验的假阳性率为23.91%，假阴性率为9.80%。在可疑混合感染组，两者的符合率为70.58%，快速ESBLs筛查试验的假阳性率为54.05%，假阴性率为10.42%。在可疑阴性组，两者的符合率为99.77%。结论 快速ESBLs筛查实验方法简单、宜行，并且快速，可以用来作为尿路感染患者尿培养标本细菌药敏实验的初步结果指导UTI治疗。

尿路感染；超广谱β-内酰胺酶；快速；筛查

尿路感染(urinary tract infection，UTI)是临床常见的感染性疾病之一，治疗方面多种抗生素均可用于治疗UTI。在引起UTI的致病菌中，以革兰阴性杆菌为主，其中产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)耐药菌株占所培养出的革兰阴性杆菌的60%以上[1-3]。针对UTI推荐的经验性治疗抗感染药物，一般需要满足耐药率低于10%的要求，但卫生部细菌耐药监测结果显示：除呋喃妥因外，尚无其他能满足广谱需要的单种口服抗生素用于治疗UTI。由于传统的培养和药敏方法耗时较长，不能及时报告细菌耐药结果，一方面造成无效治疗，另一方面增加患者负担，造成疾病迁延不愈，因此快速准确鉴别出产超广谱β-ESBLs致病菌在UTI治疗中非常重要。本研究探讨快速超广谱β-ESBLs筛查实验在UTI中的应用价值，为及时有效治疗UTI提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集2013年1月至2013年12月我院住院疑似UTI患者送检中段尿培养标本1 160份。所有标本为晨起留取的中段尿，2 h内送检。患者中男109例，女1 051例；年龄1～96岁，平均(56.2±1.5)岁。

1.2 仪器与试剂 惠州市阳光生物科技公司SS-1000B型细菌测定/药敏分析仪及配套检测板；DNM-9602型酶标仪为北京普朗新技术公司产品；抗菌药敏纸片、血基础培养基、M-H培养基、肉汤培养基为英国Oxoid公司产品；ESBLs筛查培养基为肉汤培养基中添加头孢噻肟至终浓度2.0 μg/ml。

1.3 方法

1.3.1 标本筛选和预处理:取中段尿标本5 ml加入无菌离心管中，1 000 g/min离心1 min，上清转移至另一无菌离心管中，5 000 g/min离心20 min，吸弃上清留底部约0.2 ml混匀，取50 μl滴加在玻片上自然干燥，固定后染色镜检，镜检仅发现革兰阴性杆菌为可疑革兰阴性杆菌感染组，镜检仅发现革兰阳性球菌做为可疑革兰阳性球菌感染组，镜检仅发现念珠菌做为可疑念珠菌感染组，镜检发现两种以上细菌做为可疑混合感染组，镜检未发现细菌做为可疑阴性组，然后再进行下一步实验。

1.3.2 快速ESBLs筛查试验:取可疑革兰阴性杆菌感染组、可疑混合感染组、和可疑阴性组离心后尿标本50 μl加入到950 μl快速ESBLs筛查培养基中混匀，取200 μl加入到96孔无菌培养板中，每个标本均做3个复孔。将培养板放入酶标仪中，轻振板1次，检测波长600 nm吸光度值。然后将培养板放入35℃温箱中保湿培养4 h，取出在酶标仪中检测波长600 nm吸光度值。结果判定：每个样本3个复孔吸光度值明显改变，≥2倍初始值判为ESBLs阳性。

1.3.3 常规尿标本的细菌培养、鉴定和药敏:中段尿标本常规培养按临床检验操作规程[4]方法进行，利用阳光生物SS-1000B型细菌测定/药敏分析仪和微量生化管鉴定细菌到种。药敏试验采用阳光生物SS-1000B型细菌测定/药敏分析仪测定。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922购自中国工业微生物菌种保藏中心。

1.3.4 ESBLs确认试验:采用美国临床实验室标准化协会推荐的ESBLs表型确证试验，按照常规 标准纸片扩散法进行操作。方法为将常规培养的待检菌株用0.9%氯化钠溶液配成0.5麦氏单位菌液，以3个不同角度均应涂布于MH琼脂板上，贴上每片含头孢他啶(30 μg)、头孢他啶/克拉维酸(30 μg/10 μg)、头孢噻肟(30 μg)、头孢噻肟/克拉维酸(30 μg/10 μg)的药敏纸片，当复合物药敏纸片抑菌环直径大于或等于单一药敏纸片5 mm，即判定为ESBLs阳性。

2 结果

2.1 标本筛选与分组情况 经离心涂片镜检的方法筛选，1 160份标本中526份(45.34%)为可疑革兰阴性杆菌感染，103份(8.88%)为可疑革兰阳性球菌感染，85份(7.33%)为可疑混合感染，15份(1.29%)为可疑念珠菌感染，其他431份(37.16%)为可疑阴性。

2.2 常规尿标本细菌培养和鉴定结果 1 160份尿标本共检测到细菌768株，其中大肠埃希菌422株(54.95%)，为UTI的主要致病菌。见表1。

表1 768株细菌构成比

2.3 ESBLs确认试验和快速筛查试验在不同组中检测情况 在可疑革兰阴性杆菌感染组、可疑混合感染组和可疑阴性组3组中，确认试验共检测到产ESBLs菌株阳性标本346例(33.21%)，快速筛查试验共检测到产ESBLs菌株阳性标本386例(37.04%)，两者阳性率比较差异无统计学意义(χ2=3.369，P=0.066)。见表2。

表2 不同组别样本中产ESBLs菌株的检测情况 例(%)

注:与ESBLs确认试验比较,*P<0.05

2.4 ESBLs确认试验和快速ESBLs筛查试验的一致性 在可疑革兰阴性杆菌感染组，可疑混合感染组和可疑阴性组3组共1 042例样本中，两种方法均为阳性的标本例数为311例(29.85%)，均为阴性的样本例数为621例(59.60%)，两者总的符合率为89.45%；在可疑革兰阴性杆菌感染组，两者的符合率为84.03%，以ESBLs确认试验为标准，快速筛查试验的假阳性率为23.91%，假阴性率为9.80%。在可疑混合感染组，两者的符合率为70.58%，以ESBLs确认试验为标准，快速筛查试验的假阳性率为54.05%，假阴性率为10.42%。在可疑阴性组431例标本中，仅有一例ESBLs确认试验阳性，快速ESBLs筛查试验阴性，其他完全符合，符合率为99.77%。见表3、4。

表3 可疑革兰阴性杆菌感染组产ESBLs菌株检测情况 例

表4 可疑混合感染组产ESBLs菌株检测情况 例

3 讨论

ESBLs主要是革兰阴性菌尤其是由肠杆菌科细菌产生的，其编码基因位于细菌的质粒上，耐药性可通过质粒在细菌间扩散。ESBLs能够水解青霉素类、头孢菌素类和单环β-内酰胺类抗生素，从而使抗生素失效。近年来，随着广谱抗菌药物的广泛使用，细菌耐药性尤其是产ESBLs的菌株所致的耐药性迅速增加[5]，此耐药菌株不仅在细菌间传播，而且还能够在患者间甚至医院之间互相传播[6]，给临床的抗感染治疗带来极大困难。

自从1983年首次分离出ESBLs以来，产ESBLs菌株引起的感染发病率在逐渐提高，在UTI中ESBLs阳性菌株引起的泌尿系感染占分离培养出革兰阴性杆菌的60%以上[1-3]，因此准确及时的检测出产ESBLs的耐药菌株，选择合适的治疗药物，对UTI的治疗非常重要。然而传统的ESBLs确认实验首先需要经过细菌培养、分离、鉴定和药敏过程，需要48 h以上的时间，严重影响患者的用药治疗，并增加患者负担，因此，在UTI治疗中，建立快速、准确的检测产ESBLs菌株的方法有很大的实用价值。国外对检测产ESBLs菌株的方法进行了许多研究，包括纸片确证实验、肉汤稀释法、双纸片协同法和三维实验等[7]，但这些方法的共同缺点是都需要分离菌株，用时较长。现在最新的方法是应用多重PCR的方法[8]，虽然准确性较高用时较短，但操作繁琐对实验条件要求较高，现在还不能广泛推广使用。因此我们以肉汤稀释法为基础，建立UTI快速ESBLs筛查试验。本实验首先将尿标本低速离心去除引起标本浑浊的尿中沉淀物，然后高速离心最大程度的浓缩细菌，液体培养基使细菌快速增值，4 h 即可进行检测，原因：(1)实验证明大多革兰阴性杆菌在4 h既可检测到快速增值，而相应的球菌或念珠菌大量增殖需要5 h以上或更长的时间，最大程度避免了干扰；(2)为了患者当天可以拿到初步检测结果，用来指导临床用药。

由于革兰阳性球菌和念珠菌不产生超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)，所以本研究仅针对可疑单一革兰阴性杆菌感染、可疑混合感染和可疑阴性组标本。本研究结果表明，结合尿标本离心涂片，快速ESBLs筛查试验与确认试验总的符合率为89.45%。可疑革兰阴性杆菌感染组两者的符合率为84.03%，引起假阳性的原因主要是由鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌等的非ESBLs来源的耐药菌株引起的，假阴性主要是因为患者尿标本中菌量较低或者患者采样近期应用抗生素等因素引起的。在可疑混合感染组两者的符合率为70.58%，除了与可疑革兰阴性杆菌感染组类似的原因，革兰阳性球菌以及念珠菌的干扰也是一个原因。在可疑阴性组，两者的符合率高达99.77%，提示快速ESBLs筛查试验的阴性预测值对无细菌感染的尿标本有很高的准确性。ESBLs筛查试验目的应该是能够最大程度的给医生提供抗生素治疗建议，虽然快速ESBLs筛查试验假阳性较高，但是由于引起假阳性菌株多是耐药菌株，所以仍具有参考意义；针对假阴性患者，由于主要是因为尿标本中菌量较低引起，这部分患者一般都属于慢性病患者，而且多经过抗生素治疗，可以考虑暂不治疗等细菌培养分离确认结果后再进行治疗。快速ESBLs筛查试验虽然有许多不完善，但是对于UTI临床抗生素治疗仍有很大的参考意义。

综上所述，UTI感染和复发作为一种常见病，细菌培养和药敏试验用来指导UTI感染治疗存在诸多不足，耗时较长，受细菌生物膜影响体外药敏试验敏感抗生素体内无效等。所以如何合理应用抗生素，有效治疗UTI，减少复发，临床实验室有许多工作要做。快速ESBLs筛查试验做为一种耐药菌的初筛实验，应用有很大的局限性，但对于减少盲目用药，避免无效治疗，减轻患者负担，避免更多的耐药菌产生仍具有积极的意义。

1 齐慧敏,吕媛.卫生部全国细菌耐药监测网2011年女性尿标本来源细菌耐药监测.中国临床药理学杂志,2012,28:899-904.

2 齐慧敏,吕媛,钱霞.卫生部全国细菌耐药监测网2010年女性尿标本来源细菌耐药监测.中国临床药理学杂志,2011,27:913-918.

3 郑波,吕媛.卫生部全国细菌耐药监测网2011年男性尿标本来源细菌耐药监测.中国临床药理学杂志,2012,28:893-898.

4 叶应妩,王毓三,申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第1版.南京:东南大学出版社,2006.743-744.

5 韩松涛,曾德鹏,徐梅,等.产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌的耐药机制研究.检验医学与临床,2016,13:1638-1640.

6 李丹.产ESBLs菌株的流行现状及耐药性分析.中国医药科学,2012,13:54-56.

7 孙长贵,陈汉美.超广谱β-内酰胺酶及其实验室筛检.临床检验杂志,2000,18:52-55.

8 Zefiryn C,Katar S,Alicja G,et al.Usability application of multiplex polymerase chain reaction in the diagnosis of microorganisms isolated from urine of patients treated in cancer hospital.Radiol Oncol,2013,47:296-303.

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.13.028

050082 石家庄市，中国人民解放军白求恩国际和平医院检验实验科

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