咯利普兰通过 NF-κB抑制MRP8/14在RAW264.7细胞中促炎性因子的释放*

杨 晨， 王 俊， 黄 林， 罗海华， 姜 勇， 刘爱华△

(南方医科大学 1南方医院呼吸内科， 2病理生理学教研室和广东省蛋白质组学重点实验室， 广东 广州 510515)

咯利普兰通过 NF-κB抑制MRP8/14在RAW264.7细胞中促炎性因子的释放*

杨 晨1， 王 俊1， 黄 林1， 罗海华2， 姜 勇2， 刘爱华1△

(南方医科大学1南方医院呼吸内科，2病理生理学教研室和广东省蛋白质组学重点实验室， 广东 广州 510515)

目的： 探讨PDE4抑制剂咯利普兰抑制髓样相关蛋白8/14(MRP8/14)对小鼠巨噬细胞系RAW264.7中促炎性因子释放的刺激作用，并研究核因子κB(NF-κB)在其中的作用。方法: MRP8/14刺激RAW264.7细胞，采用液相芯片技术和实时荧光定量PCR (qPCR)技术分别检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)的蛋白和mRNA水平；咯利普兰预处理RAW264.7细胞后，MRP8/14刺激细胞，采用液相芯片技术和qPCR技术分别检测TNF-α和IL-6的蛋白水平和mRNA水平；Western blot法检测NF-κB P65蛋白磷酸化水平；间接免疫荧光法检测RAW264.7细胞内NF-κB P65蛋白核移位情况。结果: 液相芯片及qPCR结果显示MRP8/14具有很强的促炎性因子TNF-α和IL-6释放的作用(P<0.01)，而咯利普兰可以显著减弱MRP8/14促炎性因子释放的作用(P<0.05)。此外，MRP8/14能够诱导NF-κB P65蛋白发生磷酸化，胞核中P65蛋白增加；而咯利普兰显著减弱NF-κB P65蛋白磷酸化(P<0.05)。结论: 咯利普兰可能通过NF-κB途径显著减弱MRP8/14的促炎作用。

急性肺损伤； 咯利普兰； 髓样相关蛋白8/14； 炎性因子； 核因子κB

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是由多种炎症介质和细胞因子介导的、以弥漫性肺泡壁毛细血管通透性增加为特征的炎症损伤性疾病，临床多表现为急性、进行性、缺氧性呼吸衰竭,是临床常见的危重症之一[1]。

髓样相关蛋白8(myeloid-related protein 8， MRP8；又称S100A8蛋白)与MRP14蛋白(S100A9蛋白)属于钙结合蛋白S100蛋白家族的成员，两者常以钙离子依赖性的方式形成异源二聚体MRP8/14[2]。研究发现，MRP8/14作为新的炎性组分可以激活巨噬细胞，通过核因子κB (nuclear factor-κB，NF-κB)途径转录合成肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎性因子，TNF-α的激活又可促进巨噬细胞合成分泌白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8等大量相关炎性因子，从而产生炎性因子的放大效应，可诱发、加重肺损伤[3]。

磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)4能特异性地水解环磷腺苷[4]。研究发现，选择性PDE4抑制剂咯利普兰(rolipram)能抑制中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的炎性趋化，抑制单核巨噬细胞、气道上皮细胞等释放趋化因子、炎性因子以及黏附分子等，起到抑制炎症的作用[5]。

本研究旨在探讨咯利普兰是否可以通过NF-κB抑制MRP8/14的促炎性因子TNF-α、IL-6等释放作用及炎症放大效应，减轻肺损伤，为急性肺损伤的诊疗提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 细胞培养

小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7由本实验室保存，采用含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2条件下进行培养，待细胞生长至80% 融合度时进行传代。

2 主要试剂

含His标签的鼠MRP8及MRP14原核表达载体pET-14b/MRP8和pET-14b/MRP14由本实验室构建并保存；Trizol总RNA提取试剂、LB培养基购自Invitrogen；DMEM培养基和胎牛血清购Gibco；RT Profiler PCR Array Kit 购自Qiagen；ReverTra Ace qPCR RT Kit购自TOYOBO；Fast Start Universal SYBR Green Master购自Roche；细胞因子检测试剂盒购自EMD Millipore；磷酸化NF-κB P65及HRP标记的抗鼠IgG购自Cell Signaling Technology；lamin B1单克隆抗体购自Proteintech；P65特异性抗体购自Abcam；羊抗兔IgG-HRP和β-actin抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Alexa Fluor 488标记的驴抗兔IgG购自Molecular Probes；Super Signal West Pico化学发光底物购自Thermo；咯利普兰购自Selleck；引物合成由华大基因公司完成；其它试剂均为进口分装或国产分析纯。

3 主要方法

3.1 MRP8/14蛋白制备 采用原核表达系统表达含His标签的MRP8及MRP14蛋白，按照蛋白纯化的标准步骤，经镍离子亲和层析柱纯化，透析并过滤，然后用12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定蛋白纯度，使用BCA法进行蛋白定量后，制备所得蛋白单体按等摩尔数混合于制备液中[10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，0.1%胆酸钠， 1 mmol/L乙二胺四乙酸, 1 mmol/L β-巯基乙醇]，加入CaCl2使其在储备液中终浓度为2 mmol/L，室温孵育10 min后将制备得到的蛋白复合物于实验前与多黏菌B(polymyxin B，PMB)10 mg/L 孵育30 min，以阻断纯化所得的蛋白中脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的生物学活性，具体方法见参考文献[6]。

3.2 MRP8/14刺激RAW264.7细胞后检测培养上清炎性因子TNF-α和IL-6的水平 取对数生长期细胞，以5×105接种于24孔板中，分别设计0 h、3 h、6 h、12 h和24 h组，每组设计3个复孔，待细胞生长至融合度达80%按照实验设计的时点加入1.5 mg/L的MRP8/14蛋白二聚体，刺激时点到后收集细胞培养上清，利用液相芯片技术(LiquiChip)检测炎症因子TNF-α和IL-6的水平。具体检测方法按试剂盒操作说明进行。

3.3 MRP8/14刺激RAW264.7细胞后检测炎性因子TNF-α和IL-6的mRNA表达水平 取对数生长期细胞，以1×106接种于6孔板中，分别设 0 h、3 h、6 h、12 h和24 h组，待细胞生长至融合度达80%时按照实验设计的时点加入1.5 mg /L 的MRP8/14蛋白二聚体，刺激时间到后收集各组细胞，按照说明书提取总RNA，定量后将总RNA按TaKaRa逆转录试剂盒说明书逆转录成cDNA。TNF-α、IL-6和β-actin扩增的上、下游引物见表1，然后利用ABI 7500系统进行定量分析。

表1 TNF-α、IL-6和β-actin的引物序列

Table 1.The primer sequences of TNF-α, IL-6 and β-actin for qPCR

NameForwardprimer(5’-3’)Reverseprimer(5’-3’)TNF-αCCGAACCCTCCACTCAGATGACAAGGTACAACCCATCIL-6CCACTTCACAAGAGGCTTAAGTGCATCATCGTTGTTACβ-actinGCGAGCACAGCTTCTTTGCGCGACGCGATATCGTCATC

3.4 咯利普兰对MRP8/14刺激细胞后培养上清炎性因子TNF-α和IL-6水平的影响 取对数生长期细胞，以5×105接种于24孔板中，分别设计对照组、咯利普兰组、MRP8/14组和咯利普兰+MRP8/14组，每组设计3个复孔，待细胞生长至融合度达80%按照实验设计预先加入10 μmol/L的咯利普兰处理细胞1 h后，再加入1.5 mg/L的MRP8/14蛋白二聚体刺激3 h后收集细胞培养上清，利用液相芯片检测炎症因子TNF-α、IL-6的水平。具体检测方法按试剂盒操作说明进行。

3.5 咯利普兰对MRP8/14刺激RAW264.7细胞后炎性因子TNF-α和IL-6 mRNA表达水平的影响 取对数生长期细胞，以1×106接种于6孔板中，分别设计对照组、咯利普兰组、MRP8/14组和咯利普兰+MRP8/14组，待细胞生长至融合度达80%时按照实验设计预先加入10 μmol/L的咯利普兰处理细胞1 h后，再加入1.5 mg/L 的MRP8/14蛋白二聚体刺激3 h后收集各组细胞，按照说明书提取总RNA，定量后将总RNA按TaKaRa逆转录试剂盒说明书逆转录成cDNA。扩增后利用ABI 7500系统进行定量分析。

3.6 细胞核内NF-κB P65蛋白水平检测 取对数生长期细胞，以2×106接种于10 cm皿，不同时点(0、30、60、120和240 min)加入1.5 mg/L的MRP8/14蛋白二聚体刺激细胞，收取细胞进行核质分离。具体方法如下：每皿加入2 mL匀浆缓冲液，收取细胞置于冰上孵育15 min，加入10 μL 10% NP40，混匀后，4 ℃ 800×g离心5 min，弃上清，匀浆缓冲液重悬洗涤沉淀3次，最后加入60 μL核提取缓冲液，冰上孵育1 h，4 ℃ 18 000×g离心25 min后取上清即为核蛋白。然后进行Western blot实验， I 抗为NF-κB P65(1∶1 000)和lamin B1(1∶1 000)，室温孵育4 h， II 抗分别为HRP标记的IgG(1∶5 000)，室温孵育1 h，经Super Signal West Pico化学发光底物显色，利用Kodak IS4000R图像工作站进行化学发光检测。图片扫描后使用Gel-Pro软件测量蛋白条带的灰度值，以P65/lamin B1比值行半定量分析

3.7 间接免疫荧光标记检测NF-κB P65的定位 1×104个细胞接种于Petri皿中，37 ℃、5% CO2条件下培养24 h后给予MRP8/14(1.5 mg/L)刺激1 h，4%多聚甲醛室温固定10 min，0.2% Triton X-100室温处理10 min，3%BSA封闭1 h，加入 I 抗(NF-κB P65，1∶100稀释)孵育过夜，洗涤后加入 II 抗(Alexa Fluor 488标记的IgG，1∶100稀释)避光孵育1 h，洗涤后加入DAPI (1∶200)避光孵育30 min，漂洗后使用Zeiss共聚焦显微镜观察拍照。

3.8 细胞核内NF-κB P65蛋白水平检测 取对数生长期细胞，以2×106接种于6孔板中，分别设计对照组、咯利普兰组、MRP8/14组和咯利普兰+MRP8/14组，待细胞生长至融合度达80%，加入10 μmol/L的咯利普兰预刺激细胞1 h，然后加入1.5 mg/L的MRP8/14蛋白二聚体刺激细胞1 h后收取细胞进行蛋白提取，方法如下: 每孔加入100 μL细胞裂解液，收集细胞，将其置于冰上裂解30 min，然后4 ℃ 18 000×g离心25 min，吸取上清，上清即为总蛋白；将各组细胞总蛋白进行Western blot 实验， I 抗为p-NF-κB P65(1∶1 000)和NF-κB P65(1∶1 000)，室温孵育过夜，II 抗为HRP标记的IgG(1∶5 000)，室温孵育1 h，其余步骤同3.6。

4 统计学处理

实验数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，两组间比较采用t检验，多个样本均数的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 MRP8及MRP14蛋白纯化鉴定

使用镍离子亲和层析柱纯化MRP8及MRP14蛋白单体，SDS-PAGE进行鉴定分析，结果显示纯化的蛋白质分子大小与预期相同，纯度>90%，见图1。

Figure 1.Purification of MRP8 and MRP14 fusion proteins.

图1 MRP8及MRP14蛋白的纯化

2 MRP8/14刺激RAW264.7细胞后炎性因子TNF-α和IL-6表达水平的检测

细胞因子测定结果显示，与对照组相比，MRP8/14能够促进炎性因子TNF-α和IL-6的大量产生。加入1.5 mg/L的MRP8/14后TNF-α在3 h达高峰并且一直维持在较高水平；IL-6在3 h显著升高并维持递增趋势；qPCR结果也显示了大致相同的趋势，见图2。

Figure 2.The effect of MRP8/14 on the releases of TNF-α and IL-6 in the RAW264.7 cells. A: the releases of TNF-α and IL-6 were quantified by LiquiChip; B: the mRNA expression of TNF-α and IL-6 was quantified by qPCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 h.

图2 MRP8/14对炎性因子TNF-α和IL-6释放的影响

3 咯利普兰对MRP8/14刺激细胞后炎性因子TNF-α和IL-6表达水平的影响

液相芯片技术和qPCR结果显示，与MRP8/14组相比，咯利普兰能显著抑制MRP8/14诱导的促炎因子TNF-α和IL-6的释放，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

Figure 3.The effect of rolipram on the releases of TNF-α and IL-6 induced by MRP8/14 in the RAW264.7 cells. A: the releases of TNF-α and IL-6 were measured by LiquiChip; B: the mRNA expression of TNF-α and IL-6 was determined by qPCR. Con： control； R: rolipram; R+M: rolipram+MRP8/14. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCon；#P<0.05vsMRP8/14.

图3 咯利普兰对MRP8/14促炎性因子TNF-α和IL-6释放的影响

4 咯利普兰对MRP8/14促RAW264.7细胞NF-κB P65移位的影响

MRP8/14刺激RAW264.7细胞不同时点，Western blot法检测胞核内NF-κB P65的蛋白水平，实验发现MRP8/14刺激细胞60 min时胞核内NF-κB P65蛋白水平达到高峰，随后，细胞核内NF-κB P65蛋白水平随着刺激时间的延长逐渐降低，见图4。根据以上结果我们选取60 min时点刺激细胞，进行间接免疫荧光检测，结果显示与对照组相比，MRP8/14能明显诱导NF-κB P65蛋白的细胞移位，而咯利普兰+MRP8/14则显著减弱NF-κB P65蛋白的细胞移位，见图5。

Figure 4.The effect of MRP8/14 (1.5 mg/L) on the location of NF-κB P65 in the RAW264.7 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 min.

图4 MRP8/14对A549细胞NF-κB P65定位的影响

Figure 5.The effect of rolipram on the location of NF-κB P65 induced by MRP8/14 in RAW264.7 cells. Con： control； R+M: rolipram+MRP8/14.

图5 咯利普兰对MRP8/14活化的 NF-κB P65蛋白定位的影响

5 咯利普兰对MRP8/14促RAW264.7细胞NF-κB P65磷酸化的影响

MRP8/14刺激RAW264.7细胞1 h，用Western blot法检测NF-κB P65蛋白磷酸化情况，结果显示与对照组相比，MRP8/14能够使NF-κB P65发生显著的磷酸化；而咯利普兰+MRP8/14组则能显著减弱NF-κB P65的蛋白磷酸化，见图6。

Figure 6.The effect of rolipram on the phosphorylation of NF-κB P65 induced by MRP8/14 in the RAW264.7 cells. Con： control； R: rolipram； M: MRP8/14; R+M: rolipram+MRP8/14. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCon；#P<0.05vsMRP8/14.

图6 咯利普兰对MRP8/14活化的 NF-κB P65蛋白磷酸化的影响

讨 论

ALI是临床上常见的危重症之一，其不仅是单纯意义上的肺部疾病,同时也是全身系统炎症性疾病的肺部表现,主要表现为炎症反应和免疫调节失控导致促炎细胞因子释放,并通过细胞间的信息传导,炎症反应进一步放大,促炎与抗炎机制失衡,从而导致肺损伤加重[7-8]。MRP8/14蛋白属于损伤相关模式分子的成员，有研究发现ALI病人的血清和肺泡灌洗中能检测到大量MPR8/14蛋白。也有研究称MRP8/14作为新的炎性组分可以活化肺组织和肺泡巨噬细胞，通过Toll样受体等进一步激活NF-κB信号通路转录合成大量的炎性因子TNF-α，TNF-α的激活又可促使巨噬细胞产生IL-6、IL-8等其它更多的促炎因子，促发级联反应，从而诱发、加重急性肺损伤[9]。本实验通过液相芯片技术和qPCR技术证实了MRP8/14可以通过刺激巨噬细胞系RAW264.7细胞产生大量的促炎因子TNF-α、IL-6等。

PDE是降解细胞内第二信使cAMP和环磷酸鸟苷(cGMP)的关键酶，参与多种细胞功能调节[10]。迄今，在哺乳动物已经发现了21种PDE基因编码不同的PDE，而PDE4主要存在于免疫炎症细胞内，参与多种炎症反应调节，包括慢性阻塞性肺疾病、哮喘以及炎症性肠病等[11]。选择性PDE4抑制剂可通过抑制多种炎症介质、细胞因子释放，调节Th1/Th2平衡，抑制白细胞活化、呼吸爆发、抑制细胞黏附因子的表达等来起到抗炎的作用[12]。本课题采用选择性PDE4抑制剂咯利普兰预处理RAW264.7细胞，然后给予MRP8/14刺激细胞，液相芯片技术和qPCR结果显示，咯利普兰可以有效的降低MRP8/14所致的促炎因子TNF-α和IL-6的表达。

有研究发现咯利普兰可以通过MKP-1调节丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路介导下游的NF-κB途径来影响LPS所致的炎性因子TNF-α的表达，从而发挥抗炎作用[13]。也有研究称当MRP8/14刺激巨噬细胞时，可以通过NF-κB途径介导大量促炎因子的转录合成，其中TNF-α和IL-6就是最先转录合成的炎性因子[14-15]；本课题组前期的研究发现MRP8/14可以通过NF-κB途径调节巨噬细胞向M1型转化，从而产生大量的炎性因子，像TNF-α、IL-6以及诱导型一氧化氮合酶等。于是，我们推测咯利普兰是否也可以通过Toll样受体4激活MAPK信号通路以及下游的NF-κB来调节MRP8/14的促炎作用，本课题初步采用Western blot技术检测了NF-κB P65量的变化以及间接免疫荧光技术观察了NF-κB P65的细胞定位情况；同时也采用Western blot技术检测了NF-κB P65的磷酸化情况。结果提示MRP8/14可以促进NF-κB P65的移位和磷酸化；而咯利普兰可以显著减弱由MRP8/14所致的NF-κB P65蛋白的细胞移位现象以及NF-κB P65的蛋白磷酸化。因此我们推测咯利普兰可能通过干预NF-κB P65的磷酸化来抑制MPR8/14的促炎性因子释放作用。

综上所述，MRP8/14可以通过NF-κB途径促进TNF-α、IL-6等炎症因子的基因转录和合成而放大促炎细胞因子的反应, 从而可能诱发、加重肺损伤。同时，咯利普兰可通过抑制NF-κB/P65蛋白的核移位和蛋白磷酸化减弱MRP8/14的促炎性因子释放作用及放大效应，从而为急性肺损伤的治疗提供新的思路。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Rolipram represses MRP8/14-induced pro-inflammatory cytokine releases in RAW264.7 cells through NF-κB activation

YANG Chen1, WANG Jun1, HUANG Lin1, LUO Hai-hua2, JIANG Yong2, LIU Ai-hua1

(1DepartmentofRespiratoryDisease,NanfangHospital，2DepartmentofPathophysiology,KeyLaboratoryofProteomicsofGuangdongProvince,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:lah47158@aliyun.com.cn)

AIM: To investigate the inhibitory effect of PDE4 inhibitor rolipram on the releases of inflammatory cytokines in mouse macrophages (RAW264.7 cells) induced by myeloid-related protein 8/14 (MRP8/14), and to explore the role of nuclear factor-κB (NF-κB) in this process. METHODS: RAW264.7 cells were treated with MRP8/14. The inflammatory cytokines TNF-α and IL-6 were determined by LiquiChip and qPCR. In contrast, RAW264.7 cells were pretreated with rolipram prior to MRP8/14 exposure. After MRP8/14 challenge, the inflammatory cytokines TNF-α and IL-6 were determined by LiquiChip and qPCR. Moreover, the phosphorylation level of NF-κB P65 was determined by Western blot. The nuclear translocation of NF-κB P65 in RAW264.7 cells was detected by indirect immunofluorescence. RESULTS: The results of LiquiChip and qPCR showed that MRP8/14 enhanced the expression of TNF-α and IL-6 (P<0.01)， while pretreatment with rolipram markedly down-regulated the level of inflammatory cytokines induced by MRP8/14 (P<0.05). Meanwhile, MRP8/14 significantly activated the phosphorylation of NF-κB P65, and the protein expression of p65 in the nucleus was increased， while pretreatment with rolipram suppressed the phosphorylation of NF-κB P65 induced by MRP8/14. CONCLUSION: Rolipram may significantly reduce the releases of the inflammatory cytokines induced by MRP8/14 through the NF-κB signaling.

Acute lung injury; Rolipram; Myeloid-related protein 8/14; Inflammatory factors; Nuclear factor-κB

1000- 4718(2017)06- 1098- 06

2017- 01- 09

2017- 05- 03

国家自然科学基金资助项目(No. 81372030)；国家自然科学基金-广东省联合基金重点项目(No. U1601225)；广东省科技计划项目(No. 2016A020216015)

R363.2+1； R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.023

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 020-61641575; E-mail: lah47158@aliyun.com.cn