淫羊藿苷对前列腺癌细胞株活力、迁移与侵袭的作用*

张温花, 张文超, 于远东

(1山东大学齐鲁医院泌尿外科, 山东 济南 250012; 2德州市人民医院泌尿外科, 山东 德州 253014； 3河南省直第三人民医院泌尿外科, 河南 郑州 450006)

淫羊藿苷对前列腺癌细胞株活力、迁移与侵袭的作用*

张温花1, 张文超2▲, 于远东3△

(1山东大学齐鲁医院泌尿外科, 山东 济南 250012;2德州市人民医院泌尿外科, 山东 德州 253014；3河南省直第三人民医院泌尿外科, 河南 郑州 450006)

目的： 探讨淫羊藿苷对前列腺癌细胞株Du145与PC3的存活、迁移与侵袭能力的影响，并初步研究其机制。方法：CCK-8法检测不同浓度淫羊藿苷(0、5、10、20、40和80 μmol/L)对Du145细胞与PC3细胞活力的影响；Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭能力；Western blot检测Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1蛋白水平。结果：MTT法检测结果显示淫羊藿苷呈浓度依赖性抑制Du145与PC3细胞的活力，当浓度到达40 μmol/L时，抑制作用达到最大；经淫羊藿苷干预后，Du145和PC3细胞迁移和侵袭能力显著下降，Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1蛋白表达水平显著下降。结论：淫羊藿苷具有抑制前列腺癌细胞株Du145与PC3生长、迁移和侵袭的作用，其作用机制可能与淫羊藿苷抑制Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1蛋白的表达有关。

淫羊藿苷； 前列腺癌细胞； 细胞活力； 细胞迁移； 细胞侵袭

前列腺癌是男性常见的泌尿系统恶性肿瘤，其发病率在欧美国家高居第一位，死亡率位于第二位[1]，我国的发病率虽低于发达国家，但随着生活水平日益提高与环境变化，发病率逐年升高[2]。目前，前列腺癌的发病机制尚未清晰。多数患者在就诊时，已发生远处转移，错过了最佳的手术机会。为了更有效地治疗前列腺癌，学者们不停致力于研究其发生的分子机制，以期实现前列腺癌的早期诊断与治疗。

现代药理学研究表明淫羊藿苷(icariin，ICA)是小檗科重要植物淫羊藿的主要活性成分，具有抗衰老、提高免疫力与抑制肿瘤等药理作用。研究发现淫羊藿苷能够拮抗雷公藤多苷导致的睾丸病理损伤，促使精原细胞增殖与分化，生精小管壁变厚，促进精子的形成[3]。国内学者将淫羊藿苷加入含肝素的mTBM液中，进行金霉素荧光染色法结合体外受精实验，发现淫羊藿苷明显促进新鲜猪精子的体外获能效果[4]。肿瘤细胞的黏附、迁移和侵袭能力是肿瘤浸润与发生远处转移的关键环节。张京伟等[5]发现淫羊藿苷对人胃癌细胞株SGC-7901的黏附、迁移和侵袭能力具有抑制作用。目前尚未有文献报道淫羊藿苷对前列腺癌细胞的影响。

材 料 和 方 法

1 实验材料与试剂

前列腺癌细胞株Du145与PC3购自上海邦景实业有限公司；RPMI-1640培养基购自HyClone；胎牛血清购自上海研卉生物科技有限公司；淫羊藿苷购自中国药品生物制品鉴定所，用二甲基亚砜(终浓度<0.01%)溶解成相应浓度；MTT试剂购自Sigma；Transwell小室购自Corning；抗Notch-1、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、MMP-9、Hes-1和GAPDH抗体购自Santa Cruz。

2 实验方法

2.1 细胞培养 将前列腺癌细胞株Du145与PC3加入含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素溶液的RPMI-1640培养基，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，待细胞融合至80%～90%时，用0.25%胰酶消化3 min，进行传代。

2.2 MTT法检测细胞存活率 待Du145细胞与PC3细胞的密度达到约80%～90%左右时进行传代，取对数生长期细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1.5×107/L，每孔100 μL接种于96孔板中，设3个复孔。细胞贴壁后，加入淫羊藿苷使最终浓度为0、5、10、20、40与80 μmol/L，分别培养12 h、24 h和48 h，每孔加入MTT试剂20 μL，37 ℃继续培养4 h，吸去孔内液体，每孔加入DMSO 150 μL，摇床上低速振荡10 min，于490 nm波长处测定吸光度(A)值，计算细胞存活率。

2.3 实验分组 实验共分为3组，空白对照(control)组,不加任何处理；溶剂对照组(vehicle组),加入相应体积溶剂；ICA组，给予40 μmol/L淫羊藿苷处理48 h。

2.4 Transwell小室迁移实验 取生长良好的对数生长期的细胞，0.25%胰蛋白酶消化，离心后弃上清，调整细胞密度为2×108/L，往上室加入200 μL细胞悬液，下室加入500 μL含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基；将Transwell小室置于37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育24 h，取出上室，用棉签擦去上室细胞，用4%多聚甲醛固定下室面的细胞15 min；PBS洗涤3次，0.1%结晶紫染色3 min，蒸馏水漂洗，吹干，置于显微镜下观察，计数。

2.5 Transwell小室侵袭实验 实验前用50 mg/L Matrigel 1∶8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干，后述步骤与2.4一样。

2.6 Western blot检测蛋白表达 收集细胞，用RIPA细胞裂解液进行裂解，提取总蛋白，测定蛋白含量，调整蛋白浓度。取适量裂解产物，上样后用10%聚丙烯酰胺进行电泳分离，电转至硝酸纤维素膜上，加入5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入 I 抗(Notch-1、MMP-2与MMP-9： 1∶1 000； Hes-1和GAPDH： 1∶500)室温孵育1 h，洗膜，加入相应 II 抗(1∶1 000)室温孵育1 h，化学发光法显色，成像扫描分析系统测定蛋白条带的积分光密度。

3 统计学处理

所有数据采用统计学软件SPSS 15.0进行分析处理。计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间均数采用单因素方差分析，各组均数间两两比较采用Bonferroni校正的t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 不同浓度淫羊藿苷对Du145细胞与PC3细胞活力的影响

与0 μmol/L组相比，其它各组的Du145细胞与PC3细胞的活力受到抑制，随着淫羊藿苷浓度的升高，Du145细胞与PC3细胞的活力受到抑制的程度越来越显著，呈剂量依赖性，如图1所示，当淫羊藿苷浓度为40 μmol/L时，细胞培养48 h后，细胞活力与80 μmol/L组的差异无统计学显著性，故后续实验采用40 μmol/L培养细胞48 h。

2 淫羊藿苷对Du145与PC3细胞迁移能力的影响

Transwell迁移实验结果显示，给予40 μmol/L淫羊藿苷处理48 h后，Du145与PC3细胞迁移数明显小于空白对照组；空白对照组与溶剂对照组间的差异没有统计学显著性，见图2。

3 淫羊藿苷对Du145细胞与PC3细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭实验结果显示，给予40 μmol/L淫羊藿苷处理48 h后，Du145与PC3细胞侵袭数明显小于空白对照组；空白对照组与溶剂对照组间的差异没有统计学显著性，见图3。

Figure 1.The effects of icariin (ICA) on the viability of the prostate cancer lines Du145 and PC3. Mean±SD.n=3.

图1 淫羊藿苷对Du145细胞和PC3细胞相对存活率的影响

4 Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表达水平变化

Western blot实验结果显示，给予40 μmol/L淫羊藿苷处理48 h后，Du145细胞与PC3细胞中Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表达水平显著低于空白对照组，空白对照组与溶剂对照组间的差异没有统计学显著性，见图4。

讨 论

本实验研究发现淫羊藿苷呈浓度依赖性抑制前列腺癌Du145细胞的活力，当淫羊藿苷浓度为40 μmol/L时，细胞的存活率仅为(39.54±3.29)%，提示淫羊藿苷对前列腺癌细胞具有明显的抑制作用。

Notch受体是一组高度保守的跨膜蛋白，与细胞的增殖、分化及凋亡具有密切关系。研究表明MMPs与Notch-1通路的信号有关，MMPs是一类锌依赖性的蛋白水解酶，与肿瘤迁移转移及血管重塑密切相关[6]，MMP-2与MMP-9是MMPs家族中的一员[7-8]。

Figure 2.The effects of icariin (ICA) on the migration ability of the prostate cancer cell lines Du145 and PC3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsICA group.

图2 淫羊藿苷对前列腺癌DU145细胞和PC3细胞迁移能力的影响

Figure 3.The effects of icariin (ICA) on the invasion ability of the prostate cancer cell lines Du145 and PC3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsICA group.

图3 淫羊藿苷对前列腺癌DU145细胞和PC3细胞侵袭能力的影响

Figure 4.The protein expression of Notch-1, MMP-2, MMP-9 and Hes-1 in the Du145 cells and PC3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsICA group.

图4 Du145细胞和PC3细胞中Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1蛋白表达水平的变化

MMP-2通过水解细胞外基质成分促使肿瘤细胞突破限制，向周围组织侵袭[9]。研究发现在宫颈癌、肾细胞癌和食管鳞癌等肿瘤中MMP-9的表达升高，其通过降解细胞外机制促进肿瘤细胞的侵袭转移过程[10]。另有研究表明，淫羊藿苷可以通过选择性诱导细胞周期阻滞对前列腺癌PC3细胞的增殖具有抑制作用[11]。肿瘤的局部转移是癌症致死率高的重要原因之一，基底膜与细胞外基质的完整性丧失与肿瘤的转移关系密切。Hes-1作为Notch-1通路下游的靶基因，在Notch-1通路中起重要作用。本实验研究发现给予淫羊藿苷干预后，前列腺癌细胞Du145的迁移与侵袭能力下降，可能与Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表达水平下调有关，推测淫羊藿苷可能通过抑制Notch-1通路，从而对前列腺癌细胞的生长、迁移与侵袭中发挥调控作用。

综上所述，淫羊藿苷对前列腺癌细胞的活力、迁移与侵袭具有明显的抑制作用，临床上可用于前列腺癌患者的辅助治疗。本研究为淫羊藿苷在临床上的应用提供了实验基础。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Effects of icariin on viability, migration and invasion of prostate cancer cells

ZHANG Wen-hua1, ZHANG Wen-chao2, YU Yuan-dong3

(1DepartmentsofUrology,QiluHospitalofShandongUniversity,Jinan250012,China;2DepartmentsofUrology,DezhouPeople’sHospital,Dezhou253014,China;3DepartmentsofUrology,theThirdPeople’sHospitalofHenanProvince,Zhengzhou450006,China.E-mail:yuyinhua81@126.com)

AIM: To investigate the effects of icariin on the viability, migration and invasion of the prostate cancer lines Du145 and PC3. METHODS: Du145 cells and PC3 cells were treated with icariin at different concentrations (0, 5, 10, 20, 40 or 80 μmol/L), and the cell viability was measured by CCK-8 assay. The cell migration and invasion abilities were detected by Transwell assay. The protein expression of Notch-1, matrix metalloproteinase (MMP)-2, MMP-9 and hairy/enhancer of split-1 (Hes-1) was determined by Western blot. RESULTS: The results of MTT assay revealed that icariin inhibited the viabilitiy of Du145 cells and PC3 cells in a dose-dependent manner. The maximal effect was at dose of 40 μmol/L. Icariin treatment significantly decreased the abilities of migration and invasion of Du145 cells and PC-3 cells. Moreover, the protein expression of Notch-1, MMP-2, MMP-9 and Hes-1 was dramatically reduced after icariin treatment. CONCLUSION: Icariin inhibits prostate cancer cell viability, migration and invasion by decreasing the protein expression of Notch-1, MMP-2, MMP-9 and Hes-1.

Icariin; Prostate cancer cell; Cell viability; Cell migration; Cell invasion

1000- 4718(2017)06- 1017- 04

2016- 10- 18

2017- 02- 28

国家自然科学基金资助项目(No. 81172435)

R737.15; R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.010

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 0371-65228506； E-mail: yuyinhua81@126.com

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