Sonic hedgehog信号通路与食管癌放射抗拒的相关性研究*

贺昱霖， 刘佳琪， 刘 群， 李 欢， 龙 辉， 孟忠吉， 吴清明△

(武汉科技大学 1医学院， 2附属天佑医院消化内科， 湖北 武汉 430065；3十堰市太和医院生物医学研究所， 湖北 十堰 442000)

Sonic hedgehog信号通路与食管癌放射抗拒的相关性研究*

贺昱霖1,3， 刘佳琪1， 刘 群2， 李 欢2， 龙 辉2， 孟忠吉3， 吴清明1△

(武汉科技大学1医学院，2附属天佑医院消化内科， 湖北 武汉 430065；3十堰市太和医院生物医学研究所， 湖北 十堰 442000)

目的： 研究Sonic hedgehog (Shh)信号通路在食管癌放射抗拒中的作用及机制。方法: 以人食管癌细胞Eca109为亲本株，通过X射线反复照射(累计照射剂量60 Gy)诱导形成放射抗拒细胞株Eca109R。分别采用集落形成实验检测细胞放射敏感性，CCK-8实验检测细胞活力的变化，来证实放射抗拒细胞株Eca109R的放射抗拒性。免疫荧光及Western blot检测Eca109R和亲本细胞Eca109内Gli1蛋白与Shh蛋白的表达。结果: 集落形成实验显示2 Gy的X线照射后，Eca109和Eca109R细胞的存活分数(SF2)分别为0.499±0.042和0.937±0.013；同时，CCK-8实验显示，Eca109R细胞的活力抑制率明显低于Eca109细胞(P<0.05)，证实Eca109R细胞有明显的放射抗拒性，诱导形成放射抗拒株成功。免疫荧光结果显示Eca109R细胞中Gli1表达明显高于Eca109细胞(P<0.05)。Western blot实验结果显示Eca109R细胞中的Gli1与Shh蛋白表达明显高于Eca109细胞(P<0.05)。结论: 食管癌放射抗拒性的产生可能与Shh信号通路相关蛋白的过表达有关。

食管癌； 放射抗拒性； Sonic hedgehog信号通路

食管癌(esophageal cancer)是消化系统常见的恶性肿瘤之一，其在世界范围内的发病率位于恶性肿瘤的第8位，死亡率位于第6位[1-2]，放射治疗是最有效的治疗手段之一，但放射治疗可能引起肿瘤对放疗产生抗拒性。近年来，有研究发现，Sonic hedgehog (Shh)信号通路与消化道肿瘤的发生密切相关[3-4]，Gli1是Shh信号通路下游的转录因子，Gli1表达水平的上调代表Shh信号通路的激活,食管鳞癌中存在Shh信号通路相关基因的高表达[5-6]。本实验通过反复照射食管癌细胞系Eca109，建立食管癌放射抗拒细胞系，并检测细胞中Gli1与Shh蛋白的表达，探究Shh信号通路与食管癌放射抗拒性之间的关系，为临床提高食管癌放疗疗效提供新的方案和依据。

材 料 和 方 法

1 细胞株、主要试剂与仪器

人食管癌细胞株Eca109(由十堰太和医院李胜保博士惠赠)；DMEM培养基(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青公司产品)；CCK-8试剂盒(Sigma)；抗Gli1抗体和抗Shh抗体(北京博奥森公司)。二氧化碳培养箱和超净工作台(Thermo Fisher)。

2 方法

2.1 细胞培养 Eca109细胞系于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，放置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱内培养。

2.2 细胞照射 采用Varian 2300直线加速器6 MV X射线照射，照射野6 cm×4 cm，源靶距80 cm，培养瓶表面覆盖1.5 cm厚的补偿块，吸收剂量率为2 Gy/min。取指数生长期Eca109细胞1瓶，用直线加速器照射2 Gy、1 min。之后继续放入细胞培养箱中培养，待照射后细胞稳定生长并增长至接近长满瓶底时，用0.25%胰蛋白酶(含0.25%EDTA)消化细胞，重新接种培养，待细胞增殖进入指数生长期时，再次X射线照射2 Gy、1 min。重复以上过程，照射30次，共60 Gy。然后传代培养至细胞形态、增殖状态稳定，即筛选得到放射抗拒细胞系，将该放射抗拒细胞命名为Eca109R。继续培养14 d后取部分细胞冻存，部分继续传代培养，在不再照射的情况下常规传代>50代，仍保持较高的放射抗拒性。

2.3 细胞形态学观察 光学显微镜下观察细胞单层贴壁后指数生长期的细胞形态学差异。

2.4 集落形成实验检测细胞放射敏感性 将指数生长期Eca109细胞和Eca109R细胞消化计数后制备成单细胞悬液，根据不同细胞数目(4×102、4×102、8×102、1×103和1.2×103)接种于6孔板，贴壁12 h后，进行细胞照射，照射剂量分别为0、2、4、6和8 Gy，继续培养14 d，出现肉眼可见的集落。用甲醇固定，结晶紫染色，计数集落数(>50个细胞的集落)。用单击多靶模型计算细胞放射敏感性参数，包括平均致死剂量(mean lethal dose，D0)、准阈剂量(quasi-threshold dose，Dq)、外推值(extrapolation value，N)以及照射2 Gy后细胞存活分数(survival fraction at 2 Gy，SF2)，实验重复3次。

2.5 CCK-8实验检测细胞活力 取经过2、4、6和8 Gy剂量照射对数期生长的Eca109和Eca109R细胞，分别将其制成单细胞悬液后并计数，接种于96孔板，每孔约5 000个细胞，放置于细胞培养箱培养72 h后加入10 μL CCK-8溶液，放入培养箱中培养1 h，在酶标仪450 nm波长下测各孔吸光度(A)值，根据各组细胞在450 nm下的A值，用公式计算细胞活力抑制率，抑制率(IR)=(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×100%，实验重复3次。

2.6 免疫荧光检测Gli1蛋白的表达 制备Eca109和Eca109R细胞爬片，甲醇固定15 min，山羊血清封闭10 min，加Gil1抗体(1∶100)，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，加 II 抗，避光孵育1.5 h，PBS 洗3次，每次10 min，DAPI复染10 min，封片，荧光显微镜镜检照相。

2.7 Western blot检测Gli1和Shh蛋白的表达 用RIPA裂解液分别提取Eca109细胞和Eca109R细胞的总蛋白，用BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白浓度，煮沸变性，每孔加样35 μg蛋白，采用SDS-PAGE(2 h)分离蛋白，之后转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭2 h，I 抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，II 抗室温下孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL化学发光法检测蛋白的表达，对图像进行灰度分析，实验重复3次。

3 统计学处理

采用SPSS 14.0对数据进行统计分析，数据用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Eca109细胞和Eca109R细胞形态学

相差显微镜下可见2种细胞呈单层贴壁生长，高倍镜下见Eca109R细胞呈不规则梭型，细胞核小，细胞质颗粒密集；Eca109细胞呈圆形或不规则多边形，细胞核中染色体折光性强，见图1。

2 Eca109细胞和Eca109R细胞放射敏感性

Eca109细胞与Eca109R细胞照射2、4、6和8 Gy剂量后，用单击多靶模型拟合，Eca109与Eca109R细胞存活分数见图2。2组细胞对应剂量的细胞存活分数相比，差异有统计学意义(P<0.05)，可见Eca109R细胞有明显的放射抗拒性。相关放射生物学参数见表1，Eca109R细胞D0、Dq和N值均高于Eca109细胞，差异有统计学意义(P<0.05)。

Figure 1.Observation of cell morphology (optical microscope, ×400).

图1 细胞形态学观察

Figure 2.The survival fractions of the Eca109 cells and Eca109R cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsEca109.

图2 Eca109与Eca109R细胞存活分数的比较

3 Eca109细胞和Eca109R细胞活力的变化

经过不同剂量照射后，Eca109R细胞各个剂量的活力抑制率均明显低于Eca109细胞对应剂量，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

4 Eca109R细胞高表达Shh和Gli1蛋白

Gli1蛋白的相对分子质量是118 kD，Shh蛋白的相对分子质量是50 kD，内参照蛋白β-actin的相对分子质量是42 kD。结果显示，Eca109细胞和Eca109R细胞中均有Gli1蛋白和Shh蛋白的表达，但Eca109R细胞中Gli1蛋白和Shh蛋白的表达明显高于Eca109细胞，见图4。

5 Eca109R中Gli1蛋白向细胞核聚集

Eca109和Eca109R 细胞胞核及胞浆均有Gli1蛋白表达，Eca109R中大部分细胞的胞浆Gli1蛋白向细胞核聚集。Eca109与Eca109R 细胞的免疫荧光阳性细胞率分别为52.3%±0.035%和87.6%±0.021%，差异有统计学意义(P<0.05)，见图5。

表1 X射线照射对Eca109与Eca109R细胞放射生物学参数的影响

N: extrapolation value; D0: mean lethal dose; Dq: quasi-threshold dose; SF2: survival fraction at 2 Gy.

Figure 3.The inhibitory rate of the cell viability. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsEca109.

图3 细胞活力抑制率的比较

讨 论

我国属于食管癌高发地区，放射治疗是最有效的治疗手段之一，但不同患者对放疗的敏感性不同，疗效差异大，究其原因，除了与肿瘤靶区勾画、剂量要求不一等因素有关外，肿瘤细胞自身对放射线就存在一定的抗拒性，也成为导致放疗疗效有限甚至失败的重要原因。目前，对于肿瘤细胞放射抗拒机制的研究已经有很多，涉及了多种复杂的因素，如细胞周期紊乱、DNA的损伤、修复，放射所致细胞信号转导通路改变、血管形成、细胞微环境、细胞的凋亡、分化等[7]。Shh信号转导通路由Shh配体、2个跨膜蛋白质受体Ptch和Smo组成的受体复合物以及下游的转录因子Gli蛋白(Gli1、Gli2和Gli3)等组成。在没有Shh配体信号刺激时，Ptch抑制Smo的活性。当Shh与Ptch结合后，解除了Ptch对Smo的抑制，释放的Smo进入细胞内，引发细胞内信号下传，激活下游转录因子Gli家族，调节包括Wnt、Ptc、cyclin D1、N-Myc在内的多种靶基因的表达，从而导致与细胞增殖、凋亡等相关的事件发生[8]。Gli1是Shh下游靶基因的强激活子，被认为是Shh信号通路的可信标志。Shh信号通常在成人正常组织中不表达，仅在参与组织的修复时激活。成人Shh信号通路过度激活可导致细胞过度增殖、抑制细胞凋亡，最终导致肿瘤的发生。近年来已有多项研究表明，Shh信号通路的异常激活与多种肿瘤形成有关，如神经母细胞瘤、乳腺癌、小细胞肺癌和结肠癌等[9-12]，而且在对浸润性乳腺癌患者进行研究后发现癌组织中Shh、Ptch-1、Gli1和Smo的mRNA呈高表达的患者肿瘤复发率高[13]。最近的研究发现，人食管鳞癌组织中Shh的阳性表达明显高于癌旁组织，且Shh蛋白的表达与食管鳞癌患者的TNM分期有关[14]。因此，进一步研究Shh信号通路与食管癌的关系具有重要意义。

Figure 4.The protein expression of Shh and Gli1 in the Eca109 cells and Eca109R cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsEca109.

图4 Eca109细胞与Eca109R细胞中Shh与Gli1蛋白表达水平的比较

Figure 5.Observation of the Gli1 immunofluorescence staining (fluorescence microscope, ×400).

图5 Gli1的免疫荧光染色

本实验利用X射线反复照射人食管癌细胞系Eca109，诱导出放射抗拒细胞系Eca109R，应用单击多靶模型进行计算后，得出的放射生物学参数显示Eca109R细胞的N 值、D0及Dq均增大，提示抗拒株Eca109R细胞比亲本株Eca109细胞更具放射抗性，同时，细胞活力抑制率提示Eca109R细胞的活力明显高于Eca109，证实了Eca109R细胞放射抗性的产生。Western blot结果显示Gli1蛋白与Shh蛋白在Eca109R细胞中的表达明显高于Eca109细胞，而免疫荧光结果显示Eca109R细胞内Gli1蛋白呈现与亲本细胞显著异常的表达水平和模式。已经有研究表明，Shh信号通路的激活与食管鳞癌的发展有关，食管鳞癌中存在Shh信号通路相关基因的高表达，而高表达Gli1的食管鳞癌患者对放射治疗不敏感[6, 15]，这与我们的研究结果是一致的，因此，Shh信号通路的激活可能与食管鳞癌的放射抗拒性有关。Shh蛋白表达与Gli1蛋白表达一致，说明可能由于Shh信号通路上游的配体过表达，引起Gli1蛋白表达上调，从而影响肿瘤细胞的增殖。

食管癌放射抗拒性形成的机理相当复杂，有待进一步深究。通过本实验，建立了食管癌放射抗拒细胞系，证实了引起食管癌放射抗拒的重要原因之一是Shh信号通路的过度激活，为进一步研究Shh信号通路的激活诱导放射抗拒的机制提供了新的实验基础，Shh信号通路的其它相关分子如Ptch-1、Smo等在Eca109R细胞的表达情况有待于进一步完善。

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(责任编辑： 卢 萍, 罗 森)

Relationship between Sonic hedgehog signaling pathways and radioresistance of esophageal cancer

HE Yu-lin1, 3, LIU Jia-qi1, LIU Qun2, LI Huan2, LONG Hui2, MENG Zhong-ji3, WU Qing-ming1

(1SchoolofMedicine,2DepartmentofGastroenterology,AffiliatedTianyouHospital,WuhanUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430065,China;3InstituteofBiomedicine,TaiheHospitalofShiyanCity,Shiyan442000,China.E-mail:wuhe9224@sina.com)

AIM: To investigate the potential role of Sonic hedgehog (Shh) signaling pathways in the radioresistance of esophageal cancer. METHODS: Radioresistant cell line Eca109R was established by repeating X-ray irradiation at dose of 60 Gy in total using Eca109 cells as parental cells. The radiosensitivity of the parental and radioresistant cells was confirmed by colony formation assay. The cell viability was detected by CCK-8 assay. The intracellular protein levels of Shh and Gli1 were determined by Western blot and immunofluorescence.RESULTS: The survival fractions at dose of 2 Gy for Eca109R cells and Eca109 cells were 0.937±0.013 and 0.499±0.042, respectively. The inhibitory rate of cell viability decreased gradually in the Eca109R cells (P<0.05), suggesting that the radioresistant cell line was successfully established. The results of Western blot indicated that the protein expression of Shh and Gli1 was much higher in the Eca109R cells than that in the Eca109 cells (P<0.05). Immunofluorescence staining showed that Gli1 was expressed in the cytoplasm and nucleus, and presented nuclear clustering in the Eca109R cells. The positive rate of Gil1 expression in Eca109 cells was 52.3%± 0.035%, while that in Eca109R cells was 87.6%±0.021% (P<0.05).CONCLUSION: The radioresistance of esophageal cancer may be related to the activation of Shh signaling pathways with over-expression of Gli1 and other related proteins.

Esophageal cancer; Radioresistance; Sonic hedgehog signaling pathways

1000- 4718(2017)06- 1043- 05

2016- 11- 30

2017- 02- 10

湖北省自然科学基金资助项目(No. 2014CFB818)；湖北省医学领军人才工程补助

R735.1; R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.014

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 027-68893438; E-mail: wuhe9224@sina.com