Ski在大鼠活化星形胶质细胞中表达的变化*

赵 鑫， 寇江力， 郭永强， 蒲彦川， 周开升， 南 伟， 汪 静， 伍亚民， 张海鸿

(1兰州大学第二医院骨科， 2甘肃省骨关节疾病研究重点实验室， 甘肃 兰州 730030； 3第三军医大学大坪医院野战外科研究所三室， 创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室， 重庆 400042)

Ski在大鼠活化星形胶质细胞中表达的变化*

赵 鑫1, 2， 寇江力1, 2， 郭永强1, 2， 蒲彦川1, 2， 周开升1, 2， 南 伟1, 2， 汪 静2， 伍亚民3， 张海鸿1

(1兰州大学第二医院骨科，2甘肃省骨关节疾病研究重点实验室， 甘肃 兰州 730030；3第三军医大学大坪医院野战外科研究所三室， 创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室， 重庆 400042)

目的： 探究Ski在大鼠正常及活化星形胶质细胞中的表达及随时间变化的规律。方法: 提取大鼠大脑皮质，分离星形胶质细胞，体外培养。采用LPS刺激和细胞划痕损伤2种方法活化星形胶质细胞，均采用Western blot法检测各个时点2种活化星形胶质细胞中Ski和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)蛋白表达情况，利用间接免疫荧光法检测Ski蛋白在星形胶质细胞中的表达定位。结果: GFAP蛋白在星形胶质细胞中固有表达，LPS活化和划痕损伤后表达均上调。Ski在正常星形胶质细胞中呈低表达状态，1 mg/L LPS活化星形胶质细胞后，Ski表达开始增加，4 d时表达量最高(P<0.05)，6 d时开始下降，但仍高于未活化组；细胞划痕损伤后Ski蛋白表达情况与上述情况高度一致。Ski在正常及LPS活化6 d星形胶质细胞中表达主要集中在胞核，LPS活化后2和4 d时在胞质中出现明确的Ski表达。结论: Ski蛋白表达于星形胶质细胞，并在活化星形胶质细胞中表达上调。由此，我们推测Ski蛋白可能调控星形胶质细胞的活化、增殖等过程。

Ski； 胶质纤维酸性蛋白； 星形胶质细胞； 胶质瘢痕

脊髓损伤(spine cord injury，SCI)是一种严重的中枢神经系统创伤性疾病，该疾病的神经功能修复是目前医学所面临的重大难题[1]。而在中枢神经系统中，星形胶质细胞是数目最多的胶质细胞，是维持中枢神经系统正常结构和功能的基础细胞[2-3]。有研究指出，活化的星形胶质细胞在脊髓损伤急性修复期中扮演着重要的角色[4]。

近年来研究表明，Ski在创口愈合、肝脏再生、肿瘤的发生发展、血管平滑肌的增殖及骨骼肌的分化、神经系统发育过程、脊髓损伤等领域起至关重要的作用[5-6]。本课题组前期在体实验研究已报道了Ski在脊髓损伤后脊髓组织中的表达变化规律[7-8]，但Ski在细胞水平的表达规律又如何呢？为此，本实验在细胞水平研究Ski在活化星形胶质细胞中的表达规律及细胞定位，为进一步探讨Ski调控星形胶质细胞的活化、迁移及胶质瘢痕的形成奠定基础。

材 料 和 方 法

1 动物

1～3天的新生健康SD大鼠，购于甘肃省中医药大学动物实验中心。

2 主要试剂

DMEM/F12培养基和胰蛋白酶(Gibco)；胎牛血清(PAN-Biotech GmbH)；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、多聚甲醛、Trition X-100和SDS(Sigma)；RIPA裂解液和BCA蛋白定量检测试剂盒(碧云天)；小鼠抗大鼠胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein， GFAP)多克隆抗体和兔抗大鼠GFAP多克隆抗体(Proteintech)；抗Ski抗体(Santa Cruz)；小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体(Proteintech)；山羊抗小鼠IgG和FITC标记山羊抗兔IgG(Solarbio)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG(北京中杉金桥)；山羊封闭血清、DAPI溶液和PVDF膜(Solarbio)；ECL试剂盒(Millipore)。

3 主要方法

3.1 新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的提取、纯化及体外培养 取新生1～2 d内的SD大鼠乳鼠在75%乙醇中浸泡消毒，-20 ℃冰箱中冷冻麻醉5 min。剪断双侧颈动脉放血，沿“人字缝”将头皮剪开外翻，再沿头颅后正中线剪开颅骨，取出双侧大脑皮质，放入D-Hanks液中，漂洗2遍。用眼科尖镊仔细剥离脑膜。把剥离好的脑皮质放入盛有胰酶的皿器中，剪碎脑皮质，用1 mL移液器轻柔吹打至组织块消散，置入37 ℃温箱辅助胰酶充分消化脑皮质3 min。将消化后的脑皮质移至15 mL离心管中，向离心管补加完全培养基4 mL，1 500 r/min离心8 min。弃上清液，再加入12%完全培养基(DMEM/FBS)4 mL，制成细胞悬液，将其移至培养瓶中。放入37 ℃、5% CO2培养箱中孵育。之后每隔3 d用含12%胎牛血清的DMEM/F12培养基换液，培养6～8 d，待细胞融合贴满瓶壁，封口后放入37 ℃恒温旋转摇床(190 r/min)，除去悬浮细胞和贴壁不牢的细胞，6 h后取出，进行传代培养即可获得纯化的星形胶质细胞。

3.2 星形胶质细胞鉴定及纯度计数 GFAP作为星形胶质细胞特异性标记蛋白[9-10]，采用GFAP细胞免疫荧光染色法对星形胶质细胞进行纯度鉴定，在荧光显微镜高倍视野(×200)下随机选取5个视野进行纯度计数。星形胶质细胞纯度=每一观察视野内GFAP阳性细胞数/总细胞数。纯度达到96%以上的星形胶质细胞符合本实验要求。

3.3 LPS活化细胞模形的建立及其分组 将处于对数生长期的星形胶质细胞随机分为2组：空白对照组；LPS单一刺激组。LPS单一刺激组再分6个亚组，采用浓度为0.001、0.01、0.1、1、10和100 mg/L的LPS分别作用于细胞8 h。采用Western blot法检测各组GFAP蛋白的表达量。将处于对数生长期的星形胶质细胞重新随机分为2组：空白对照组；LPS单一刺激组。单一刺激组再分4个亚组，取LPS终浓度为1 mg/L，刺激后继续培养时间分别为2、4、6和8 d。采用Western blot法检测各组Ski蛋白的表达量。各组均设3个皿。

3.4 细胞划痕损伤模形的建立 参考文献[11-12]建立细胞损伤模形的方法并加以改良。将纯化后的原代星形胶质细胞传代接种于6孔板中培养，直至细胞长满融合。采用预先设计好的标准模版，其上划有纵、横网格线(间距均为3 mm)，将其放置在培养板的底部，吸掉培养板中的培养液并用PBS液轻柔冲洗2遍后，在超净工作台中用200 μL微量移液器吸头严格按照预先设计好的标准模版线条均匀用力制成纵、横损伤路径。之后，用PBS清洗细胞以去除损伤的细胞碎片，划伤宽度约为1 mm，补加新鲜培养基继续培养相应天数(0、1、2、4、6、8和10 d)后在倒置相差显微镜下观察细胞反应，拍照后提取总蛋白。确保同一批次实验内的星形胶质细胞损伤程度和范围一致。

3.5 Western blot实验 观察上述各组细胞生长情况，收集各组细胞提蛋白。用预冷的PBS冲洗细胞2遍，用RIPA裂解液裂解30 min，细胞刮匙刮下细胞，在4 ℃低温离心机中以转速14 000 r/min离心15 min，收集上清，弃沉淀，加入30 μL(上清液的1/3)蛋白上样液，开水煮沸3 min。BCA试剂盒测定总蛋白浓度，将其存放于-80 ℃冰箱保存待用。提取的蛋白质行10% SDS-PAGE(浓缩胶90 V，分离胶120 V)，将分离好的蛋白电转至甲醇浸透好的PVDF膜上，采用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST(10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5， 150 mmol/L NaCl， 0.5% Tween 20)洗涤10 min×3次，附加 I 抗 [兔抗大鼠GFAP多克隆抗体(1∶300)、兔抗大鼠Ski多克隆抗体(1∶100)和小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体(1∶5 000)]，4 ℃冰箱中反应过夜；TBST洗膜(方法同前)；附加II 抗[辣根过氧化物标记的山羊抗兔或抗小鼠IgG(1∶5 000)]，室温下反应2 h；TBST洗膜(方法同前)；滴加ECL发光液，在GE凝胶成像系统中测量各目的条带的灰度值，以目的蛋白的灰度值与内参照β-actin蛋白条带的灰度值之比反应目的蛋白的表达水平。实验重复3次。

3.6 免疫荧光染色检测GFAP和Ski蛋白的表达 通过免疫荧光染色法分析各活化时点(0、2、4和6 d)Ski蛋白的表达规律及细胞亚定位，观察Ski蛋白细胞亚定位及其是否随活化时间的延长而发生改变。用细胞计数板计数细胞悬液的细胞浓度，将原代纯化后的细胞以同一细胞浓度接种到盖玻片上，贴壁后用1 mg/L LPS活化星形胶质细胞，4 d后倒掉旧的培养基，用PBS清洗2遍，多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤2遍，Trition X-100通透20 min，PBS洗涤2遍，滴加山羊封闭血清，37 ℃下封闭30 min，然后吸净封闭液，勿洗，加入 I 抗 [小鼠抗大鼠GFAP多克隆抗体(1∶300)和兔抗大鼠Ski多克隆抗体(1∶100)]，将玻片置于湿盒中，于4 ℃冰箱中孵育过夜。PBS洗涤2遍，避光下加 II 抗 [山羊抗小鼠IgG(1∶300)和FITC标记山羊抗兔IgG(1∶300)]，37 ℃温箱中避光孵育90 min，PBS洗涤2遍，避光下附加DAPI，室温孵育20 min，PBS洗涤2遍。甘油封片。荧光显微镜下观察。阴性对照用PBS代替 I 抗。胞核及胞浆中出现红色或绿色荧光为阳性细胞，阴性对照细胞不出现荧光。

4 统计学处理

采用SPSS 21.0软件进行统计分析。每组数据来自3次独立的实验，数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，均数间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 体外培养SD大鼠大脑皮质星形胶质细胞形态及纯度鉴定

首次传代纯化后的星形胶质细胞在倒置相差显微镜下观察可见细胞传代培养12 h后基本贴壁生长，细胞轮廓清晰，可见细胞突起较多，且胞突之间有交叉连接，胞体形态多样，多数呈星形；活化后的细胞形态发生明显改变，如细胞胞体肥大，胞突增粗、形状不规则等(图1)。待正常细胞密度合适，给予免疫荧光化学染色，荧光显微镜下可见星形胶质细胞更为清晰的形态学特征，且胞核呈圆形或椭圆形。通过其纯度计算公式，得出星形胶质细胞纯度平均值为98%。特异性标记抗原GFAP为红色荧光，DAPI标记细胞核为蓝色荧光，均清晰可辨(图2)。

Figure 1.Appearance comparison between normal and activated astrocytes (×200).

图1 星形胶质细胞活化前后形态的对比

Figure 2.Evaluation of the astrocyte purity by GFAP expression detection (×200).

图2 通过检测GFAP表达鉴定星形胶质细胞纯度

2 划痕损伤后星形胶质细胞形态变化

划痕造成星形胶质细胞损伤后，划伤区域的星形胶质细胞胞体及胞突完全消失，损伤周围部分细胞的胞突断裂，并退缩回胞体，远隔损伤区域的星形胶质细胞形态未见明显改变。随着损伤时间的延长，损伤区周围细胞体积增大，细胞突起增粗，4 d后细胞突起彼此交织，形成网状聚集，见图3。

Figure 3.Appearance of astrocytes after scratch injury (×200).

图3 划痕损伤后星形胶质细胞的形态

3 LPS诱导星形胶质细胞中GFAP蛋白表达的最适浓度

如图4所示，各分组变量为LPS浓度，与正常对照组相比，随着LPS浓度的升高，GFAP在星形胶质细胞中的表达上调。当浓度为0.01 mg/L时，GFAP蛋白表达少量升高，与对照组相比差异无统计学显著性；当浓度大于0.01 mg/L时，GFAP表达上调程度与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，且浓度为1 mg/L时，GFAP表达量最高；当LPS浓度为10和100 mg/L时，GFAP蛋白表达量较1 mg/L有所降低，但仍高于对照组。

Figure 4.The effects of different doses of LPS on the protein level of GFAP in the astrocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L.

图4 不同浓度LPS对星形胶质细胞中GFAP蛋白表达的影响

4 LPS诱导星形胶质细胞中GFAP和Ski蛋白表达的时相变化

用1 mg/L LPS分别作用于星形胶质细胞0、2、4、6和8 d，经过不同时间的诱导活化，Ski和GFAP的表达量不同。如图5所示，LPS诱导0～4 d这一时间段，Ski和GFAP蛋白表达量逐步增加，在4 d这一时间点达到峰值(P<0.05)；活化时间4～6 d时，Ski蛋白表达量又呈现快速下降趋势，但Ski蛋白表达量仍高于对照组，具有统计学意义(P<0.05)，活化时间为8 d时，Ski蛋白表达量仍高于对照组，但差异无统计学显著性。

Figure 5.The effects of LPS (0.1 mg/L) exposure for different stimulation time on the protein expression of Ski and GFAP in the astrocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 d.

图5 0.1 mg/L LPS作用不同时间对星形胶质细胞Ski和GFAP蛋白表达的影响

5 划痕损伤后星形胶质细胞中GFAP和Ski蛋白表达的时相变化

划痕损伤后经过不同时间(0、1、2、4、6、8和10 d)，星形胶质细胞Ski和GFAP的表达量不同。如图6所示，划痕损伤0～6 d这一时段，Ski和GFAP蛋白表达量逐步增加，在6 d这一时点达到峰值(P<0.05)；活化时间6～10 d时， Ski和GFAP蛋白表达量又呈现同步下降趋势，但两者蛋白表达量仍高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。Ski和GFAP表达情况同LPS活化的星形胶质细胞结果高度一致。

Figure 6.The effects of scratch injury for different time on the protein expression of Ski and GFAP in the astrocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 d.

图6 不同作用时间的划痕损伤对星形胶质细胞Ski和GFAP蛋白的影响

6 免疫荧光染色

在免疫荧光化学染色结果显示，Ski在正常星形胶质细胞及活化星形胶质细胞中均有表达，在对照组中，Ski表达较弱，主要位于胞核，胞质中无明显表达；在活化时间为2 d时，Ski表达较对照组有所增强，且胞质中出现明显表达；活化4 d时，胞体明显增大，胞核和胞质中的表达明显增加；活化6 d时，Ski表达较4 d有所下降，胞质中的表达信号强度再次减少，随着活化时间的继续延长，Ski蛋白在胞质与胞核中的表达逐渐降低，且胞质降低要先于胞核，见图7。

讨 论

脊髓损伤致瘫率极高，因脊髓损伤导致损伤部位以下运动与感觉功能丧失的患者逐年增多，且预后较差，脊髓损伤的病理变化是由多种因素介导的复杂过程[13]。因此脊髓损伤的修复成为当今医学科研及临床工作者研究的热点、难点。

一般认为，SCI后胶质瘢痕的形成与损伤刺激、局部缺血微环境、代谢异常及炎症反应等因素有关[14]。根据文献[15-19]采用LPS活化星形胶质细胞，诱导星形胶质细胞中GFAP的上调，模拟脊髓损伤后的活化态星形胶质细胞。本次研究结果显示，LPS以浓度依赖的方式上调星形胶质细胞中GFAP蛋白的表达，当浓度为1 mg/L时，GFAP蛋白表达最高；当LPS浓度为10 mg/L时，GFAP蛋白表达量较1 mg/L有所降低，与既往研究相符[20]。

c-Ski 作为进化保守蛋白，与多种细胞的增殖、分化、转化和肿瘤发生发展相关，在多种细胞生长中具有重要的调控作用[6]；有研究发现，Ski在神经系统中可以调控神经系统胚胎发育、施万细胞增殖及胶质母细胞瘤等神经系统病理变化过程[21]。本实验是在细胞水平上研究Ski在活化星形胶质细胞中的表达规律及细胞定位，为进一步探讨Ski调控星形胶质细胞的活化、迁移及胶质瘢痕的形成奠定基础。

GFAP是星形胶质细胞特异性标志蛋白[9-10]。有研究报道[22-23]，在正常的CNS中，星形胶质细胞中GFAP蛋白表达水平较低，当星形胶质细胞受到轻微的外界刺激时，GFAP蛋白表达水平开始上升，细胞骨架结构同期开始肥大；当星形胶质细胞受到强烈刺激，并发严重胶质化时，GFAP表达显著增高，同时伴有细胞的增生；GFAP作为星形胶质细胞重要的细胞骨架结构蛋白，对星形胶质细胞的生物活性起到重要的调节作用，GFAP表达水平随着星形胶质细胞活化程度的增高而表达上升。因此GFAP的表达水平可反映星形胶质细胞的活化程度。本研究结果显示，在通过LPS诱导或细胞划痕损伤活化后的星形胶质细胞中，GFAP蛋白表达量早期逐步上升的，同以往研究结果一致[22]，标志星形胶质细胞活化成功。

另外，本研究结果显示Ski蛋白在活化星形胶质细胞中的表达具有时间依赖性。在正常星形胶质细胞中，Ski蛋白处于持续低表达状态；1 mg/L LPS诱导细胞活化后，Ski蛋白表达逐渐增高，4 d时Ski蛋白表达达到高峰，6 d时开始下降，但仍高于未活化组；此规律与GFAP蛋白在活化星形胶质细胞中的表达规律高度一致。此外，通过细胞划痕损伤来进一步体外模拟活化星形胶质细胞，在划痕损伤0～6 d这一时间段，Ski蛋白表达量逐步增加，在6 d这一时间点达到峰值；活化时间6～10 d时， Ski蛋白表达量又呈现下降趋势，但Ski蛋白表达量仍高于对照组；同样，Ski表达规律与GFAP蛋白在活化星形胶质细胞中的表达规律高度一致。因此我们推测，Ski可能调控星形胶质细胞的活化、肥大、增殖及胶质瘢痕形成。

通过免疫荧光发现，正常星形胶质细胞中，Ski蛋白主要聚集在胞核，胞质表达较少；在活化星形胶质细胞中，胞质中开始出现Ski蛋白，6 d时胞质中Ski蛋白又再次减少。我们知道，蛋白质的功能通常与其在细胞内的亚细胞定位相关，因此，通过其活化前后Ski蛋白亚定位的变化，我们可以推断，Ski在星形胶质细胞活化过程中起重要的调控作用。蛋白在细胞内的亚定位问题，是细胞生物学、分子生物学研究的中心问题，了解Ski蛋白的定位从而有助于我们探索其生物学功能。

Figure 7.The immunolocalization and change of Ski in the astrocytes (×400).

图7 Ski在星形胶质细胞中的免疫荧光定位及其变化

脊髓损伤后，星形胶质细胞反应性进入活化状态，主要表现为胞体增生肥大、突起变粗、分支增多，并向损伤区域迁移聚集，进而形成胶质瘢痕[24]。胶质瘢痕对脊髓损伤神经修复作用存在双面性。早期研究表明[25]，脊髓损伤修复的关键是提供轴突生长的通道，轴突在脊髓内能够生长，但生长的轴突必须穿过断端胶质瘢痕才能到达远端，获得运动功能的恢复。相关研究证实[26]，胶质瘢痕的形成对神经功能的恢复是不利的，胶质瘢痕形成后可作为致密的物理屏障，妨碍神经轴突的再生。近期有研究发现[27]，早期胶质瘢痕的形成发挥着重要积极的作用，如阻止有害因子的扩散，限制炎症的扩散，减少损伤区域面积，保护周围神经组织，恢复内环境稳定。研究调控胶质瘢痕生成的最佳时间窗，以充分发挥胶质瘢痕的积极作用，减少其负面影响，是本课题组今后研究的重点。

综上所述，Ski蛋白表达于星形胶质细胞，且在活化后的星形胶质细胞中表达明显增高，结合GFAP蛋白在活化星形胶质细胞中的表达规律与Ski表达规律的一致性，我们推测Ski可能作为新的信号分子，调控星形胶质细胞的活化、增殖等过程，并以此调节胶质瘢痕的形成过程。但其活化机制仍需要进一步研究。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Changes of Ski expression levels in rat activated astrocytes

ZHAO Xin1, 2, KOU Jiang-li1, 2, GUO Yong-qiang1, 2, PU Yan-chuan1, 2, ZHOU Kai-sheng1, 2, NAN Wei1, 2, WANG Jing1, 2, WU Ya-min3, ZHANG Hai-hong1

(1DepartmentofOrthopedics,SecondHospitalofLanzhouUniversity,2KeyLaboratoryofBoneandJointDiseasesofGansuProvince,Lanzhou730030,China;3StateKeyLaboratoryofTrauma,BurnsandCombinedInjury,TheThirdDepartmentofResearchInstituteofSurgery,DapingHospital,ThirdMilitaryUniversity,Chongqing400042,China.E-mail:zhanghaihong1968@sina.com)

AIM: To explore the time-dependent change of Ski protein expression in normal and activated astrocytes in rats. METHODS: The astrocytes were obtained from rat cerebral cortex and culturedinvitro. The astrocytes were treated with LPS and scratch injury for activation. Western blot analysis was used to determine glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Ski protein levels in activated astrocytes at a series of time points. The indirect immunofluorescence staining method was performed to detect the location of Ski protein in the astrocytes. RESULTS: The protein of GFAP was naturally expressed in the astrocytes, beginning to increase after treated with LPS and scratch injury. Little protein expression of Ski in the normal astrocytes was observed. The Ski protein expression began to increase after treated with 1 mg/L LPS, peaked at 4 d (P<0.05) and then deceased, but was stills higher than that in the normal cells. The protein expression level of Ski after scratch injury was highly consistent with above mentioned. Ski was mainly observed in the nucleus of the normal cells and the cells treated with LPS for 6 d, while it was observed in the cytoplasm 2 and 4 d after treated with LPS. CONCLUSION: The protein of Ski is expressed in the astrocytes, and the expression level is increased in activated astrocytes， mainly located in the nucelus. Ski may plays an essential roles in the processes of activation and proliferation of astrocytes.

Ski; Glial fibrillary acidic protein; Astrocytes; Glial scar

1000- 4718(2017)06- 0968- 07

2017- 01- 10

2017- 04- 10

国家自然科学基金资助项目(No. 30772299)

R741； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.002

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 13919343669; E-mail: zhanghaihong1968@sina.com